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系統識別號 U0002-3007200815024500
中文論文名稱 利用CD及1H NMR研究hNPY類似物的摺疊結構
英文論文名稱 Folding structure of analogues of hNPY by CD and 1H NMR
校院名稱 淡江大學
系所名稱(中) 化學學系碩士班
系所名稱(英) Department of Chemistry
學年度 96
學期 2
出版年 97
研究生中文姓名 黃品鈞
研究生英文姓名 Pin-Chun Huang
學號 695161116
學位類別 碩士
語文別 中文
口試日期 2008-07-09
論文頁數 126頁
口試委員 指導教授-李長欣
委員-陳珮燁
委員-徐駿森
中文關鍵字 核磁共振  圓二色光譜  固相胜肽合成  NPY 
英文關鍵字 NMR  CD  NPY  SPPS 
學科別分類 學科別自然科學化學
中文摘要 人類神經胜肽Y(Human Neuropeptide Y, hNPY)在水溶液中具有α-螺旋結構,且奈米莫爾濃度(nM)下結構為單體,毫莫爾濃度(mM)時則為雙體。其結構有特定作用機制:單體先與膜微脂粒(membrane micelle)結合後進一步與GPCRs(G protein-coupled receptors)作用。固相胜肽合成法(Solid Phase Peptide Synthesis)合成hNPY片段序列hNPY【11-36】,經由高效能液相層析儀純化。再由合成hNPY【18-36】,此兩胜肽經由質譜儀確認分子量,再用圓二色光譜(Circular Dichroism)觀察不同比例TFE溶液下,二級結構的變化,選擇100%水溶液與50%TFE兩溶液做結構測量與討論。用二維核磁共振(two-dimensional NMR)的光譜: TOCSY、NOESY、[1H, 13C]-HSQC及光譜判定(Assignment)和光譜循序判定(Sequential assignment),各別判定兩溶液之殘基質子與13碳的化學位移。經由NOE限制條件分別計算兩溶液之3D結構,100%水溶液呈現鬆散不規則結構,50%TFE溶液283K及310K分別在24Leu~31Ile及25Arg~31Ile出現α-螺旋結構。由DOSY光譜可得知hNPY【11-36】水溶液結構介於雙體及三體間,hNPY【18-36】 50%TFE溶液結構介於單體及雙體間。
配合CD、CSI(Chemical Shift Index)、NMR、DOSY、結構計算,討論50%TFE溶液下兩種溫度之結構差異,並與NPY結構及文獻比較。
英文摘要 Human Neuropeptide Y(hNPY) has a well-defined α-helical structure in solution, and is monomer at nM concentration, dimer at mM concentration. It has specific binding mechanism: First, the monomer structure binds with membrane micelle, and further interacts with G protein-coulpled receptors(GPCRs).
We synthesize neuropeptide fragment hNPY【11-36】by solid phase peptide synthesis, purified by RP-HPLC. Synthesize neuropeptide fragment hNPY【18-36】from and made sure the molecular weight by Mass. The conformation and dynamics of hNPY【18-36】in difference solvent condition is studied by CD and 2D NMR experiment.
2D NMR experiments of TOCSY, NOESY, and [1H, 13C]-HSQC were acquired. With NOE restrained structural calculation, the major structure of hNPY【18-36】in 100% H2O is random coil and form regular α-helical structure between 24Leu and 31Ile, 25Arg and 31Ile in 50%TFE/50% H2O 283K and 310K separately.hNPY【11-36】structure in 100%H2O between dimer and trimer by DOSY spectrum,
hNPY【18-36】structure in 50%TFE/50% H2O between monomer and dimer.
Combination of CD, NMR, and XPLOR molecular calculation, we can investigate the conformational difference between 100%H2O and 50%TFE /50%H2O, and compare with native NPY and paper.
論文目次 目錄
第一章 緖論
1.1 NPY家族 1
1.2 NPY 結構變化探討 2
1.3 研究目的 3
第二章 原理
2.1 固相胜肽合成法原理 6
2.2 圓二色光譜儀原理 10
2.3 二維核磁共振原理 16
2.4 3D理論計算原理 23
第三章 實驗材料與方法
3.1 實驗材料 32
3.2 實驗方法 39
第四章 結果 51
第五章 討論 109
第六章 結論 113
第七章 參考資料 114
附錄 119

圖片索引
圖1-1 hNPY水溶液中單體結構圖。 3
圖1-2 NPY 家族序列與結構圖示。 4
圖1-3 hNPY 水溶液之兩種雙體結構。 4
圖1-4 hNPY 與膜微脂粒(micelle)結合流程示意圖。 5
圖2-1 樹脂透過連接劑與胺基酸序列相連接。 7
圖2-2 固相胜肽合成法示意圖。 7
圖2-3 在酸、鹼性條件下去除胺端保護基。 8
圖2-4 Ninhydrin Test之反應式。 8
圖2-5 光之電場與磁場示意圖。 12
圖2-6 光通過平面極化器(polarized) 後產生單一線性光源。 13
圖2-7 左、右旋圓偏極光之合成圖。 13
圖2-8 包含著四種結構的CD吸收圖形。 15
圖2-9 包含著四種結構的CD吸收圖形(Ⅱ)。 15
圖2-10 多維脈衝序列。 24
圖2-11 二維核磁共振實驗之脈衝序列可分四個時期。 24
圖2-12 將t1 線性的增加實驗。 25
圖2-13 經過四個時期後,收集到一連串隨t1 值變化的S。 26
圖2-14 TOCSY脈衝序列。 27
圖2-15 兩個相鄰胺基酸之間質子的距離。 27
圖2-16 NOESY脈衝序列。 28
圖2-17 六個殘基經由NOE數據所計算而得的結構。 28
圖2-18 HSQC脈衝序列。 29
圖2-19 自旋反射梯度(spin echo sequence:SE)。 29
圖3-1 合成胜肽流程圖。 43
圖3-2 Rink Amide AM Resin示意圖。 44
圖3-3 最左邊區塊為N 端Fmoc 保護基。 44
圖3-4 降低消旋作用耦合試劑。 44
圖3-5 胺基酸具有Carbamate-protected,避免消旋作用發生。 45
圖3-6 HPLC 純化之光譜,main peak 出現在9.5分鐘。 45
圖3-7 ESI+-Mass 測出hNPY【11-36】之分子量為3186。 47
圖3-8 ESI+-Mass 測出hNPY【18-36】之分子量為2457。 47
圖4-1 hNPY【11-36】CD光譜圖(Ⅰ)。 59
圖4-2 hNPY【11-36】CD光譜圖(Ⅱ)。 60
圖4-3 hNPY【18-36】CD光譜圖(Ⅰ)。 61
圖4-4 hNPY【18-36】CD光譜圖(Ⅱ)。 62
圖4-5 hNPY【11-36】0%TFE~100%TFE結構百分率比較圖。 63
圖4-6 hNPY【18-36】0%TFE~100%TFE結構百分率比較圖。 63
圖4-7 hNPY【11-36】在50%D2O / 50%H2O中1D光譜。 64
圖4-8 hNPY【18-36】在20%D2O / 80%H2O中300K TOCSY光譜。 65
圖4-9 hNPY【18-36】在20%D2O / 80%H2O中300K NOESY光譜。dαN(i,i+1) 的循序判定。 66
圖4-10 hNPY【18-36】在20%D2O / 80%H2O中300K NOESY光譜。dβN(i,i+1) 的循序判定。 67
圖4-11 hNPY【18-36】在50%TFE-d3/50%H2O中283K TOCSY光譜。 68
圖4-12 hNPY【18-36】在50%TFE-d3/50%H2O中283K NOESY光譜。dαN(i,i+1) 的循序判定。 69
圖4-13 hNPY【18-36】在50%TFE-d3/50%H2O中283K NOESY光譜。dβN(i,i+1) 的循序判定。 70
圖4-14 hNPY【18-36】在50%TFE-d3/50%H2O中283K NOESY光譜。胺基酸Hα-HN的交叉峰 71
圖4-15 hNPY【18-36】在50%TFE-d3/50%H2O中283K NOESY光譜。胺基酸Hβ-HN的交叉峰 72
圖4-16 hNPY【18-36】在50%TFE-d3/50%H2O中283K NOESY光譜。dNN(i,i+1) 的交叉峰。 73
圖4-17 hNPY【18-36】在50%TFE-d3/50%H2O中283K NOESY光譜。dαβ(i,i+3) 的交叉峰。 74
圖4-18 hNPY【18-36】在50%TFE-d3/50%H2O中283K NOESY光譜。芳香環上的NOE。 75
圖4-19 hNPY【18-36】在50%TFE-d3/50%H2O中310K TOCSY光譜。 76
圖4-20 hNPY【18-36】在50%TFE-d3/50%H2O中310K NOESY光譜。dαN(i,i+1) 的循序判定。 77
圖4-21 hNPY【18-36】在50%TFE-d3/50%H2O中310K NOESY光譜。dβN(i,i+1) 的循序判定。 78
圖4-22 hNPY【18-36】在50%TFE-d3/50%H2O中310K NOESY光譜。胺基酸Hα-HN的交叉峰 79
圖4-23 hNPY【18-36】在50%TFE-d3/50%H2O中310K NOESY光譜。dNN(i,i+1) 的交叉峰。 80
圖4-24 hNPY【18-36】在50%TFE-d3/50%H2O中310K NOESY光譜。dαβ(i,i+3) 的交叉峰。 81
圖4-25 hNPY【18-36】在50%TFE-d3/50%H2O中310K NOESY光譜。芳香環上的NOE。 82
圖4-26 hNPY【11-36】在50%D2O / 50%H2O中310K DOSY光譜, 83
圖4-27 hNPY【18-36】在50%TFE-d3/50%H2O 中,各溫度之 DOSY光譜疊圖。 84
圖4-28 hNPY【18-36】20%D2O / 80%H2O,300K之Hα CSI圖示。 85
圖4-29 hNPY【18-36】在50%TFE-d3/50%H2O,283K之Hα CSI圖示。 85
圖4-30 hNPY【18-36】在50%TFE-d3/50%H2O,283K之Cα CSI圖示。 86
圖4-31 hNPY【18-36】在50%TFE-d3/50%H2O,310K之Hα CSI圖示。 86
圖4-32 hNPY【18-36】在50%TFE-d3/50%H2O,310K之Cα CSI圖示。 87
圖4-33 hNPY【18-36】在50%TFE-d3/50%H2O 的283K、310K 與文獻中hNPY【18-36】90%TFE-d2/10%H2O 308K 之Hα CSI比較圖。 87
圖4-34 hNPY【18-36】在50%TFE-d3/50%H2O 的283K、310K 與文獻中hNPY【18-36】90%TFE-d2/10%H2O 308K 之Cα CSI比較圖。 88
圖4-35 hNPY【18-36】在50%TFE-d3/50%H2O 的283K、310K 的溫度係數直條圖。 88
圖4-36 hNPY【18-36】在20%D2O / 80%H2O,300K 中30個
主幹堆疊結構。 89
圖4-37 hNPY【18-36】在20%D2O / 80%H2O,300K 中3D圖示。 89
圖4-38 hNPY【18-36】在50%TFE-d3/50%H2O,283K 中30
個主幹堆疊結構。 90
圖4-39 hNPY【18-36】在50%TFE-d3/50%H2O,283K 中30個α-螺旋部分堆疊結構。 90
圖4-40 hNPY【18-36】在50%TFE-d3/50%H2O,283K 中3D圖示。 91
圖4-41 hNPY【18-36】在50%TFE-d3/50%H2O,310K 中30
個主幹堆疊結構。 91
圖4-42 hNPY【18-36】在50%TFE-d3/50%H2O,310K 中30個α-螺旋部分堆疊結構。 92
圖4-43 hNPY【18-36】在50%TFE-d3/50%H2O,310K 中3D圖示。 92
圖4-44 hNPY【18-36】50%TFE-d3/50%H2O,283K 中兩姓α-螺旋結構示意圖。 93
圖4-45 hNPY【18-36】50%TFE-d3/50%H2O,310K 中兩姓α-螺旋結構示意圖。 93
圖4-46 hNPY【18-36】在20%D2O / 80%H2O,300K中Ramachandran plot的圖示。 94
圖4-47 hNPY【18-36】在50%TFE-d3/50%H2O,283K中Ramachandran plot的圖示。 95
圖4-48 hNPY【18-36】在50%TFE-d3/50%H2O,310K中Ramachandran plot的圖示。 96
圖4-49 四條hNPY胜肽化學位移以不同顏色表示比較圖。 97
圖4-50 hNPY【15-29】中Y20及Y21殘基示意圖。 97
圖4-51 hNPY【18-36】中Y20及Y21殘基示意圖。 98
圖4-52 hNPY【18-36】在50%TFE-d3/50%H2O,283K中有標記的殘基為疏水端支鏈。 98
圖4-53 hNPY【18-36】在50%TFE-d3/50%H2O,310K中有標記的殘基為疏水端支鏈。 99

表格索引
表2-1 連續及非連續的NOE可預測產生特定的二級結構。 29
表2-2 二十種共同胺基酸於無序纏捲時的質子化學位移表。 30
表2-3 各胺基酸Cα、CO 、Cβ 化學位移範圍。 31
表3-1 最理想耦合與去保護基反應時間。 41
表3-2 藥品名稱和分子量對照使用量。 42
表3-3 hNPY【11-36】分析時所使用的梯度。 46
表4-1 hNPY【18-36】在20%D2O / 80%H2O,300K中,1H的化學位移。 100
表4-2 hNPY【18-36】在20%D2O / 80%H2O,300K中的NOE。 100
表4-3 hNPY【18-36】在50%TFE-d3/50%H2O,283K中,1H
的化學位移。 101
表4-4 hNPY【18-36】在50%TFE-d3/50%H2O,283K中,13C
的化學位移。 102
表4-5 hNPY【18-36】在50%TFE-d3/50%H2O,283K中的NOE。 103
表4-6 hNPY【18-36】在50%TFE-d3/50%H2O,310K中,1H的化學位移。 104
表4-7 hNPY【18-36】在50%TFE-d3/50%H2O,310K中,13C的化學位移。 105
表4-8 hNPY【18-36】在50%TFE-d3/50%H2O,310K中的NOE。 106
表4-9 hNPY【11-36】50%D2O / 50%H2O 310K由DOSY計算出的分子量與理論分子量的比值。 107
表4-10 hNPY【18-36】50%TFE-d3/50%H2O不同溫度下由DOSY計算出的分子量與理論分子量的比值。 107
表4-11 hNPY【18-36】不同濃度及溫度下光譜資料統整表。 108
參考文獻 參考文獻
<1> Wang Z-L., Bennet W. M., Wang R-M., Ghatei M. A., Bloom S. R.,
“Evidence of a paracrine role of neuropeptide-Y in the regulation of insulin release from pancreatic islets of normal and
dexamethasone-treated rats.” Endocrinology, 1994, 135, 200–206.

<2> Bader, R., Bettio, A., Beck-Sickinger, A. G, and Zerbe, O. “Structure and Dynamics of Micelle-bound Neuropeptide Y: Comparison with Unligated NPY and Implications for Receptors Selection.” J. Mol. Biol. 2001, 305, 307-329.

<3> McLean, L. R., Buck, S. H., Krstenansky, J. L. “Examination of the Role of the Amphiphatic α-Helix in the Interaction of Neuropeptide Y and Active Cylic Analogues with Cell Membrane Receptors and dimyristolphosphatidylcholine” Biochemisry, 1990, 29, 2016-2022.

<4> Zhou, N. E., Zhu, Bing-Yan, Sykes, B. D., Hodges, R. S. “Relationship between Amide Ptoton Chemical Shifts and Hydrogen Bonding in Amphipathic α-Helical Peptides.” J. Am. Chem. Soc., 1992, 11, 4321-4326.

<5> Mirjam L., Hiroshi K., Gerd F., Marie-Isabel A., Annette G. B.,
Oliver Z. “Strongly Altered Receptor Binding Properties in PP
and NPY Chimeras Are Accompanied by Changes in Structure and
Membrane Binding.” Biochemistry, 2005, 44, 9255-9264.

<6> Bettio, R., Dinger, M. C., and Beck-Sickinger, A. G. “The neuropeptide Y monomer in solution is not folded in the pancreatic-polypeptide fold.” Protein Sci. 2002, 11, 1834-1844.

<7> Cowley, D. J., Hoflack, J. M., Pelton, J. T., Saudek, V. “Structure of neuropeptide Y dimer in solution.” Eur. J. Biochem. 1992, 205, 1099-1106.

<8> Minakata, H., Taylor, J.W., Walker, M.W., Miller, R.J., and Kaiser, E.T.”Characterization of amphiphilic secondary structures in neuropeptide Y through the design, synthesis, and study of model peptides.” J. Biol. Chem.,1989,264,7907–7913.


<9> Bettio, A., Beck-Sickinger, A. G. “Biophysical Methods to Study Ligand–Receptor Interactions of Neuropeptide Y.” Biopolymers Peptide Sci, 2001, 60, 420–437.

<10> Giuseppina Sabatino, Mario Chelli, Alberto Brandi and Anna M.
Papini.” Analytical Methods for Solid Phase Peptide Synthesis” Curr. Org. Chem, 2004, 8, 291-301.

<11> Bax, A., Davis, D. G. “The Factors Influencing the Peptide Affinity for Pollen Calmodulin Peptide Conformation Study by CD and 2D-NMR”J. Magn. Reson. 1985, 65, 355.

<12> Ösapay, K., Case, D. A. “A new analysis of proton chemical shifts in proteins.” J. Am. Chem. Soc. 1991, 113, 9436.

<13> Ösapay, K., Case, D. A. “Analysis of proton chemical shifts in regular secondary structure of proteins.” J. Biomol. NMR. 1994, 4, 215.

<14> Lightner, D. A., J. E. Gurst, “Organic conformational analysis and stereochemistry from circular dichroism spectroscopy.” John Wiley & Sons, Inc. 2000.

<15> Velluz, L., M. Legrand, M. Grosjean, “Optical circular dichroism.” Academic Press, Inc., 1965.

<16> Aue, W. P., Bartholdi, E., and Ernst, R. R., “Two-dimensional spectroscopy.Application to nuclear magnetic resonance.” J. Chem. Phys., 1976, 64, 2229-2246.

<17> Gronenborn, A. M., and Clore, G. M., “Protein structure determination insolution by two-dimensional and three-dimensional nuclear magnetic resonance spectroscopy.” Anal. Chem., 1990, 62, 2-15.

<18> Davis, D. G., and Bax, A., “Assignment of complex 1H NMR spectra viatwo-dimensional homonuclear hartmann-hahn spectroscopy.” J. Am. Chem. Soc., 1985, 107, 2820-2821.

<19> Withrich, K., Billeter, M. and Braun, W. “Secondary Structure of Complement Component C3a Anaphylatoxin in Solution as Determined by NMR Spectroscopy: Differences between Crystal and Solution Conformations” J. Mol. Biol., 1984,180,715-740.

<20> 丁尚武, 方菁霞. “The Dynamics of Protein CTXn from NMR Relaxation Studies.”國立中山大學化學系研究所碩士論文2004.

<21> Wüthrich, K. “NMR of proteins and nucleic acids.” Wiley, New
York, 1986.

<22> Jeener, J., Meier, B. H., Bachmann, P. and Ernst R. R. “Investigation of exchange processes by two-dimensional NMR spectroscop.”J. Chem. Phys., 1979,71, 4546-4553.

<23> Kumar, A., Wagner, G., Ernst, R. R., and Wuthrich, K., “Buildup rates of the nuclear Overhauser effect measured by two-dimensional proton magnetic resonance spectroscopy: Implications for studies of protein conformation.” J. Am. Chem. Soc.,1981, 103, 3654-3658.

<24> 丁尚武,黃麗純. “Structure and Dynamics of a Novel Cobra
Cardiotoxin CTXn as Derived from Nuclear Magnetic Resonance
Spectroscopy.” 國立中山大學化學研究所碩士論文,2003.

<25> Wagner, G.,D. Neuhaus, E.Worgotter, M. Vasak, J. R. H. Kagi, and K. Wuthrich.” Nuclear Magnetic Resonance identification of "half-turn" and 310-helix secondary structures in rabbit liver metallothionein-2.” J. Mol. Biol. , 1986, 187, 131-135.

<26> Altieri, A. S., Hinton, D. P., and Byrd, R. A., “Association of biomolecular systems via pulsed field gradient NMR self-diffusion measurements.” J. Am. Chem. Soc., 1995, 117, 7566-7567.

<27> Shenggen Yao, Geoffrey J. Howlett & Raymond S. Norton” Peptide self-association in aqueous trifluoroethanol monitored by pulsed field gradient NMR diffusion measurements.” J. Biomol. NMR, 2000, 16, 109–119.

<28> Chein, W. J., Lin, S. C., and Chang, D. K., “Self-diffusion measurement on synthetic biopolymers via pulsed field gradient NMR spectroscopy.” Bull.Lnst. Chem., Academia Sinica, 1996, 43, 53-62.

<29> Dingley, A. J., Mackay, J. P., Shaw, G. L., Hambly, B. D., and King, G. F.,“Measuring macromolecular diffusion using heteronuclear multiple -quantum pulsed-field-gradient NMR.” J. Biomol. NMR, 1997,10, 1-8.

<30> Chein, W. J., Cheng, S. F., and Chang, D. K., “Determination of the
binding constant of a protein kinase C substrate, NG(28-43), to sodium dodecyl sulfate via the diffusion coefficient measured by pulsed field gradient nuclear magnetic resonance.” Anal. Chem., 1998, 264, 211-215.

<31> D. S. Wishart, B. D. Sykes,a and F. M. Richards ”The Chemical
Shift Index: A Fast and Simple Method for the Assignment of
Protein Secondary Structure through NMR Spectroscopy”
Biochemistry, 1992, 31, 1647-1651.

<32> David S. Wishart and Brian D. Sykes”The 13C Chemical-Shift
Index: A simple method for theidentification of protein secondary
structure using 13C chemical-shift data” J. Biomol. NMR, 1994 ,4,171-180.

<33> Jirong Lu and Kathleen B. Hall “An RBD that Does Not Bind
RNA:NMR Secondary Structure Determination and Biochemical
Properties of the C-terminal RNA Binding Domain from the
Human UIA Protein” J. Mol. Biol, 1995, 247, 739-752.

<34> Sharon J. Archer, Valda K. Vinson, Thomas D. Pollard, Dennis A. Torchia “Elucidation of the poly-L-proline binding site in
Acanthamoeba profilin I by NMR spectroscopy”FEBS Letters,
1994, 337,145-151.

<35> Charles D. Schwieters, John J. Kuszewski, G. Marius Clore. “Using
Xplor-NIH for NMR molecular structure determination” Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 2006,48,47-62.

<36> Marion Gurrath, Alessandro Bisello, Katia Bottazzo, Chun-Wa Chung, Stefano Mammi and Evaristo Peggion “Conformational Analysis of Neuropeptide Y Segments by CD, NMR Spectroscopy and Restrained Molecular Dynamics” J. Peptide Sci.,1996, 2, 176-193.

<37> Dale F. Mierke, Hansjorg Durr, Horst Kessler and Gunther Jung “Neuropeptide Y:Optimized solid-phase synthesis and conformational analysis in trifluoroethanol” Eur. J. Biochem. ,1992, 206 , 39-48.

<38> Tomasz Cierpicki, Igor Zhukov, R. Andrew Byrd and Jacek Otlewski “Hydrogen Bonds in Human Ubiquitin Reflected in Temperature Coefficients of Amide Protons” J. Magn. Reson. ,2002,157, 178–180.

<39> Martine T. Reymond, Gene Merutka H, Jane Dyson, and Peter E. Wright,” Folding propensities of peptide fragments of myoglobin.” Protein Sci.,1997, 6,706-716.

<40> Meena Kanyalkar, Sudha Srivastavab, Evans Coutinho,” Conformation of a model peptide of the tandem repeat decapeptide in mussel adhesive protein by NMR and MD simulations” Biomaterials, 2002, 23,389–396.
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