人類神經胜肽Y(Human Neuropeptide Y, hNPY)在水溶液中具有α-螺旋結構，且奈米莫爾濃度(nM)下結構為單體，毫莫爾濃度(mM)時則為雙體。其結構有特定作用機制：單體先與膜微脂粒(membrane micelle)結合後進一步與GPCRs(G protein-coupled receptors)作用。固相胜肽合成法(Solid Phase Peptide Synthesis)合成hNPY片段序列hNPY【11-36】，經由高效能液相層析儀純化。再由<SIGMA-ALDRICH>合成hNPY【18-36】，此兩胜肽經由質譜儀確認分子量，再用圓二色光譜(Circular Dichroism)觀察不同比例TFE溶液下，二級結構的變化，選擇100%水溶液與50%TFE兩溶液做結構測量與討論。用二維核磁共振(two-dimensional NMR)的光譜: TOCSY、NOESY、[1H, 13C]-HSQC及光譜判定(Assignment)和光譜循序判定(Sequential assignment)，各別判定兩溶液之殘基質子與13碳的化學位移。經由NOE限制條件分別計算兩溶液之3D結構，100%水溶液呈現鬆散不規則結構，50%TFE溶液283K及310K分別在24Leu~31Ile及25Arg~31Ile出現α-螺旋結構。由DOSY光譜可得知hNPY【11-36】水溶液結構介於雙體及三體間，hNPY【18-36】 50%TFE溶液結構介於單體及雙體間。
配合CD、CSI(Chemical Shift Index)、NMR、DOSY、結構計算，討論50%TFE溶液下兩種溫度之結構差異，並與NPY結構及文獻比較。

Human Neuropeptide Y(hNPY) has a well-defined α-helical structure in solution, and is monomer at nM concentration, dimer at mM concentration. It has specific binding mechanism: First, the monomer structure binds with membrane micelle, and further interacts with G protein-coulpled receptors(GPCRs).
We synthesize neuropeptide fragment hNPY【11-36】by solid phase peptide synthesis, purified by RP-HPLC. Synthesize neuropeptide fragment hNPY【18-36】from <SIGMA-ALDRICH> and made sure the molecular weight by Mass. The conformation and dynamics of hNPY【18-36】in difference solvent condition is studied by CD and 2D NMR experiment.
2D NMR experiments of TOCSY, NOESY, and [1H, 13C]-HSQC were acquired. With NOE restrained structural calculation, the major structure of hNPY【18-36】in 100% H2O is random coil and form regular α-helical structure between 24Leu and 31Ile, 25Arg and 31Ile in 50%TFE/50% H2O 283K and 310K separately.hNPY【11-36】structure in 100%H2O between dimer and trimer by DOSY spectrum,
hNPY【18-36】structure in 50%TFE/50% H2O between monomer and dimer.
Combination of CD, NMR, and XPLOR molecular calculation, we can investigate the conformational difference between 100%H2O and 50%TFE /50%H2O, and compare with native NPY and paper.

目錄
第一章	緖論
1.1  NPY家族                                             1
1.2  NPY 結構變化探討                                    2
1.3  研究目的                                            3
第二章 原理
2.1  固相胜肽合成法原理                                  6 
2.2  圓二色光譜儀原理                                    10
2.3  二維核磁共振原理	                             16
2.4  3D理論計算原理                                      23
第三章 實驗材料與方法
3.1  實驗材料                                            32
3.2  實驗方法                                            39
第四章 結果                                              51
第五章 討論                                             109
第六章 結論                                             113
第七章 參考資料                                         114
附錄                                                    119

圖片索引
圖1-1	hNPY水溶液中單體結構圖。	3
圖1-2	NPY 家族序列與結構圖示。	4
圖1-3	hNPY 水溶液之兩種雙體結構。	4
圖1-4	hNPY 與膜微脂粒(micelle)結合流程示意圖。	5
圖2-1	樹脂透過連接劑與胺基酸序列相連接。	7
圖2-2	固相胜肽合成法示意圖。	7
圖2-3	在酸、鹼性條件下去除胺端保護基。	8
圖2-4	Ninhydrin Test之反應式。	8
圖2-5	光之電場與磁場示意圖。	12
圖2-6	光通過平面極化器(polarized) 後產生單一線性光源。	13
圖2-7	左、右旋圓偏極光之合成圖。	13
圖2-8	包含著四種結構的CD吸收圖形。	15
圖2-9	包含著四種結構的CD吸收圖形(Ⅱ)。	15
圖2-10	多維脈衝序列。	24
圖2-11	二維核磁共振實驗之脈衝序列可分四個時期。	24
圖2-12	將t1 線性的增加實驗。	25
圖2-13	經過四個時期後，收集到一連串隨t1 值變化的S。	26
圖2-14	TOCSY脈衝序列。	27
圖2-15	兩個相鄰胺基酸之間質子的距離。	27
圖2-16	NOESY脈衝序列。	28
圖2-17	六個殘基經由NOE數據所計算而得的結構。	28
圖2-18	HSQC脈衝序列。	29
圖2-19	自旋反射梯度(spin echo sequence：SE)。	29
圖3-1	合成胜肽流程圖。	43
圖3-2	Rink Amide AM Resin示意圖。	44
圖3-3	最左邊區塊為N 端Fmoc 保護基。	44
圖3-4	降低消旋作用耦合試劑。	44
圖3-5	胺基酸具有Carbamate-protected，避免消旋作用發生。	45
圖3-6	HPLC 純化之光譜，main peak 出現在9.5分鐘。	45
圖3-7	ESI+-Mass 測出hNPY【11-36】之分子量為3186。	47
圖3-8	ESI+-Mass 測出hNPY【18-36】之分子量為2457。	47
圖4-1	hNPY【11-36】CD光譜圖(Ⅰ)。	59
圖4-2	hNPY【11-36】CD光譜圖(Ⅱ)。	60
圖4-3	hNPY【18-36】CD光譜圖(Ⅰ)。	61
圖4-4	hNPY【18-36】CD光譜圖(Ⅱ)。	62
圖4-5	hNPY【11-36】0%TFE~100%TFE結構百分率比較圖。	63
圖4-6	hNPY【18-36】0%TFE~100%TFE結構百分率比較圖。	63
圖4-7	hNPY【11-36】在50％D2O / 50％H2O中1D光譜。	64
圖4-8	hNPY【18-36】在20％D2O / 80％H2O中300K TOCSY光譜。	65
圖4-9	hNPY【18-36】在20％D2O / 80％H2O中300K NOESY光譜。dαN(i,i+1) 的循序判定。	66
圖4-10	hNPY【18-36】在20％D2O / 80％H2O中300K NOESY光譜。dβN(i,i+1) 的循序判定。	67
圖4-11	hNPY【18-36】在50％TFE-d3/50％H2O中283K TOCSY光譜。	68
圖4-12	hNPY【18-36】在50％TFE-d3/50％H2O中283K NOESY光譜。dαN(i,i+1) 的循序判定。	69
圖4-13	hNPY【18-36】在50％TFE-d3/50％H2O中283K NOESY光譜。dβN(i,i+1) 的循序判定。	70
圖4-14	hNPY【18-36】在50％TFE-d3/50％H2O中283K NOESY光譜。胺基酸Hα-HN的交叉峰	71
圖4-15	hNPY【18-36】在50％TFE-d3/50％H2O中283K NOESY光譜。胺基酸Hβ-HN的交叉峰	72
圖4-16	hNPY【18-36】在50％TFE-d3/50％H2O中283K NOESY光譜。dNN(i,i+1) 的交叉峰。	73
圖4-17	hNPY【18-36】在50％TFE-d3/50％H2O中283K NOESY光譜。dαβ(i,i+3) 的交叉峰。	74
圖4-18	hNPY【18-36】在50％TFE-d3/50％H2O中283K NOESY光譜。芳香環上的NOE。	75
圖4-19	hNPY【18-36】在50％TFE-d3/50％H2O中310K TOCSY光譜。	76
圖4-20	hNPY【18-36】在50％TFE-d3/50％H2O中310K NOESY光譜。dαN(i,i+1) 的循序判定。	77
圖4-21	hNPY【18-36】在50％TFE-d3/50％H2O中310K NOESY光譜。dβN(i,i+1) 的循序判定。	78
圖4-22	hNPY【18-36】在50％TFE-d3/50％H2O中310K NOESY光譜。胺基酸Hα-HN的交叉峰	79
圖4-23	hNPY【18-36】在50％TFE-d3/50％H2O中310K NOESY光譜。dNN(i,i+1) 的交叉峰。	80
圖4-24	hNPY【18-36】在50％TFE-d3/50％H2O中310K NOESY光譜。dαβ(i,i+3) 的交叉峰。	81
圖4-25	hNPY【18-36】在50％TFE-d3/50％H2O中310K NOESY光譜。芳香環上的NOE。	82
圖4-26	hNPY【11-36】在50％D2O / 50％H2O中310K DOSY光譜，	83
圖4-27	hNPY【18-36】在50％TFE-d3/50％H2O 中，各溫度之 DOSY光譜疊圖。	84
圖4-28	hNPY【18-36】20％D2O / 80％H2O，300K之Hα CSI圖示。	85
圖4-29	hNPY【18-36】在50％TFE-d3/50％H2O，283K之Hα CSI圖示。	85
圖4-30	hNPY【18-36】在50％TFE-d3/50％H2O，283K之Cα  CSI圖示。	86
圖4-31	hNPY【18-36】在50％TFE-d3/50％H2O，310K之Hα CSI圖示。	86
圖4-32	hNPY【18-36】在50％TFE-d3/50％H2O，310K之Cα  CSI圖示。	87
圖4-33	hNPY【18-36】在50％TFE-d3/50％H2O 的283K、310K 與文獻中hNPY【18-36】90％TFE-d2/10％H2O 308K 之Hα CSI比較圖。	87
圖4-34	hNPY【18-36】在50％TFE-d3/50％H2O 的283K、310K 與文獻中hNPY【18-36】90％TFE-d2/10％H2O 308K 之Cα CSI比較圖。	88
圖4-35	hNPY【18-36】在50％TFE-d3/50％H2O 的283K、310K 的溫度係數直條圖。	88
圖4-36	hNPY【18-36】在20％D2O / 80％H2O，300K 中30個
主幹堆疊結構。	89
圖4-37	hNPY【18-36】在20％D2O / 80％H2O，300K 中3D圖示。	89
圖4-38	hNPY【18-36】在50％TFE-d3/50％H2O，283K 中30
個主幹堆疊結構。	90
圖4-39	hNPY【18-36】在50％TFE-d3/50％H2O，283K 中30個α-螺旋部分堆疊結構。	90
圖4-40	hNPY【18-36】在50％TFE-d3/50％H2O，283K 中3D圖示。	91
圖4-41	hNPY【18-36】在50％TFE-d3/50％H2O，310K 中30
個主幹堆疊結構。	91
圖4-42	hNPY【18-36】在50％TFE-d3/50％H2O，310K 中30個α-螺旋部分堆疊結構。	92
圖4-43	hNPY【18-36】在50％TFE-d3/50％H2O，310K 中3D圖示。	92
圖4-44	hNPY【18-36】50％TFE-d3/50％H2O，283K 中兩姓α-螺旋結構示意圖。	93
圖4-45	hNPY【18-36】50％TFE-d3/50％H2O，310K 中兩姓α-螺旋結構示意圖。	93
圖4-46	hNPY【18-36】在20％D2O / 80％H2O，300K中Ramachandran plot的圖示。	94
圖4-47	hNPY【18-36】在50％TFE-d3/50％H2O，283K中Ramachandran plot的圖示。	95
圖4-48	hNPY【18-36】在50％TFE-d3/50％H2O，310K中Ramachandran plot的圖示。	96
圖4-49	四條hNPY胜肽化學位移以不同顏色表示比較圖。	97
圖4-50	hNPY【15-29】中Y20及Y21殘基示意圖。	97
圖4-51	hNPY【18-36】中Y20及Y21殘基示意圖。	98
圖4-52	hNPY【18-36】在50％TFE-d3/50％H2O，283K中有標記的殘基為疏水端支鏈。	98
圖4-53	hNPY【18-36】在50％TFE-d3/50％H2O，310K中有標記的殘基為疏水端支鏈。	99

表格索引
表2-1	連續及非連續的NOE可預測產生特定的二級結構。	29
表2-2	二十種共同胺基酸於無序纏捲時的質子化學位移表。	30
表2-3	各胺基酸Cα、CO 、Cβ 化學位移範圍。	31
表3-1	最理想耦合與去保護基反應時間。	41
表3-2	藥品名稱和分子量對照使用量。	42
表3-3	hNPY【11-36】分析時所使用的梯度。	46
表4-1	hNPY【18-36】在20％D2O / 80％H2O，300K中，1H的化學位移。	100
表4-2	hNPY【18-36】在20％D2O / 80％H2O，300K中的NOE。	100
表4-3	hNPY【18-36】在50％TFE-d3/50％H2O，283K中，1H
的化學位移。	101
表4-4	hNPY【18-36】在50％TFE-d3/50％H2O，283K中，13C
的化學位移。	102
表4-5	hNPY【18-36】在50％TFE-d3/50％H2O，283K中的NOE。	103
表4-6	hNPY【18-36】在50％TFE-d3/50％H2O，310K中，1H的化學位移。	104
表4-7	hNPY【18-36】在50％TFE-d3/50％H2O，310K中，13C的化學位移。	105
表4-8	hNPY【18-36】在50％TFE-d3/50％H2O，310K中的NOE。	106
表4-9	hNPY【11-36】50％D2O / 50％H2O 310K由DOSY計算出的分子量與理論分子量的比值。	107
表4-10	hNPY【18-36】50％TFE-d3/50％H2O不同溫度下由DOSY計算出的分子量與理論分子量的比值。	107
表4-11	hNPY【18-36】不同濃度及溫度下光譜資料統整表。	108

參考文獻
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