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系統識別號 U0002-3006200515504600
中文論文名稱 利用蛋白質體學研究含吡咯環抗生素之抑菌作用
英文論文名稱 Chemical proteomics of antibiotics containing pyrrole rings
校院名稱 淡江大學
系所名稱(中) 生命科學研究所碩士班
系所名稱(英) Graduate Institute of Life Sciences
學年度 93
學期 2
出版年 94
研究生中文姓名 陳盈廷
研究生英文姓名 Ying-Ting Chen
學號 692290462
學位類別 碩士
語文別 中文
口試日期 2005-06-01
論文頁數 77頁
口試委員 指導教授-鄭建中
指導教授-鄭建中
委員-陳玉如
委員-許輝煌
委員-王志偉
中文關鍵字 蛋白質體學  偏端黴素  紡錘菌素 
英文關鍵字 proteomics  distamycin  netropsin 
學科別分類 學科別醫學與生命科學生物學
中文摘要 蛋白質體學是二十一世紀對新藥開發的重要利器。利用蛋白質體學技術標的出受抗生素影響而發生變化的蛋白質,能提供較完整的藥物以及其生物活性之間關係。本論文利用兩種已知與DNA小溝鍵結之抗生素,紡錘菌素(netropsin)與偏端黴素(distamycin)進行測試。前者在結構上少一個甲基吡咯基團,但多一個正電荷的胍基。紡錘菌素對d(GGTATACC)2鍵結能力為1×105 M-1,是偏端黴素的0.5倍。但在本實驗中,發現紡錘菌素抑制大腸桿菌BL21生長能力較強,所需的濃度低於偏端黴素八倍。基於藥物與DNA作用後,會影響蛋白質生成,導致生物活性的改變。不同濃度之紡錘菌素(7, 11, 15 µM)及偏端黴素(60, 90, 120 µM),對細菌進行培養17小時後,經破菌,丙酮或硫酸銨沈澱後進行透析,得到總體蛋白質,再經一維的等電聚焦電泳,及二維聚丙醯凝膠分離後,比對蛋白質之間的差異。再利用基質輔助雷射質譜儀鑑定出蛋白質之分子量,即可找出所對應的可能代謝途徑。為了解抗生素對蛋白質生成的調控影響,在不同時間下(3,5,8,17小時),亦分別對總體蛋白質變化進行分析。結果發現:紡錘菌素和偏端黴素在DNA雖有相似的影響,但因結構的差異性,導致所表現出的蛋白質不同,而改變細菌成長活性。因此本論文研究結果,對藥物的結構及生物活性之間的相對關係,將提供一個展新的思考方向。
英文摘要 Proteomic is an important tool for new drug discovery in the 21st century. The understanding about the influence of total proteins in drug provides the more information about the relationship between the structure of drug and biological activity. Two kinds of antibiotics, netropsin and distamycin, were examined the correlation in this thesis. These two antibiotics are known to bind at the DNA minor groove, the former structure has one less methylprrrole, this being replaced with guanidimium group carring positive charge. The binding affinities to netropsin and [d(GGTATACC)]2 are determined to be 1×105 M-1 that is half to that of distamycin. However, the inhibition concentration of netropsin in the bacterial growth is eight-times to that of distamycin. DNA modification with drug will influence its protein distribution resulting in the different of biological activity. The use of proteomic technology is capable of monitoring the variation of total protein. In our laboratory, different concentration of netropsin (7, 11, 15 µM) and distamycin (60, 90, 120 µM) was allowed to incubate with bacterial in the medium for 17 hours, respectively. Isolation and purification by acetone or ammonium sulfate precipitation, and dialysis give total proteins prior to the separation by 1-D IEF and 2-D SDS-PAGE. Comparison of the spots isolated from 2-D gel shows the different protein distribution. Determination of molecular weight of each spot by MALDI mass spectrograph provides a reasonable metabolic pathway for these antibiotics. In order to understand the kinetic data for the protein formation, total proteins was obtained for different reaction time periods of 3, 5, 8, 17 hours. It suggests that netropsin and distamycin undergo the different metabolic pathway even though they have similar components in chemical structure.These results will offer a new strategy in drug development and have great potential for overcoming drug-resistance.
論文目次 目錄
頁次
中文摘要
Abstract

第一章 緒論
1-1 研究動機 1
1-2 蛋白質體學之介紹 1
1-3 實驗目的與策略 2
1-4 蛋白質體學對新藥物的發展與應用 4
1-5 抗生素背景介紹 6
1-6 紡錘菌素和偏端黴素之介紹 8
1-7 實驗架構 14
1-7-1二維凝膠電泳 14
1-7-2 基質輔助雷射質譜儀(MALDI-TOF MS) 16
1-7-3 蛋白質鑑定 17
第二章 材料與方法
2-1 儀器 19
2-2 藥品名稱 20
2-3 藥品配表 21
2-4 實驗流程 26
2-4-1 養菌 27
2-4-2 成長曲線之測量 27
2-4-3 蛋白質之萃取 28
2-4-4 蛋白質定量 29
2-4-5 第一維電泳 30
2-4-6 二維聚丙醯凝膠電泳 34
2-4-7 二維凝膠膠體染色 35
2-4-8 蛋白質膠內酵素水解 (In-Gel Digestion) 35
第三章 結果與討論
3-1 DNA熔點之測定 38
3-2生長曲線之測定 41
3-3 蛋白質分析 45
第四章 結論 75
參考文獻 76

圖目錄 頁次
圖1-6.1 兩種抗生素之結構 9
圖1-6.2 Netropsin與DNA之1 : 1結合模式 10
圖1-6.3 鹼基配對及抗生素與DNA結合 11
圖1-6.4 Distamycin和Netropsin與DNA排序選擇性 12
圖1-6.5 Distamycin與DNA之2 : 1結合模式 13
圖1-5.2. 二維電泳蛋白質分離 15
圖1-7-2.1 基質輔助雷射脫附游離(MALDI)質譜 16
圖1-7-3.1 胜肽指紋辨識(peptide mass fingerprint) 18
圖2-4.1 實驗流程圖 26圖2-4-5.1 二維電泳操作流程 33
圖2-4-8.1 蛋白質膠內酵素水解(In-Gel Digestion) 37
圖3-1.1 Netropsin衍生物 39
圖3-2.1 A組抗生素衍生物之細菌生長曲線 42
圖3-2.2 B組抗生素衍生物之細菌生長曲線 43
圖3-2.3 C組抗生素衍生物之細菌生長曲線 43
圖3-2.4 Netropsin與distamycin之細菌生長曲線 44
圖3-3.1 抗生素濃度變化之上升趨勢 49
圖3-3.2蛋白質編號d(c)2在不同濃度distamycin之變化情形 50
圖3-3.3 蛋白質編號d9在不同濃度distamycin之變化情形 51
圖3-3.4 Distamycin 0 µM (17hrs)&二維電泳圖 52
圖3-3.5 Distamycin 60 µM (17hrs)&二維電泳圖 53
圖3-3.6 Distamycin 90 µM (17hrs)&二維電泳圖 54
圖3-3.7 Distamycin 120 µM (17 hrs)&二維電泳圖 55
圖3-3.8 Distamycin 90 µM (time:3 hrs)&二維電泳圖 56
圖3-3.9 Distamycin 90 µM (time:5 hrs)&二維電泳圖 57
圖3-3.10 Distamycin 90 µM (time:8 hrs)&二維電泳圖 58
圖3-3.11 Distamycin 90 µM (time:17 hrs)&二維電泳圖 59
圖3-3.12 Netropsin 0 µM (17 hrs)&二維電泳圖 60
圖3-3.13 Netropsin 7 µM (17 hrs)&二維電泳圖 61
圖3-3.14 Netropsin 11 µM (17 hrs)&二維電泳圖 62
圖3-3.15 Netropsin 15 µM (17 hrs)&二維電泳圖 63
圖3-3.16 Netropsin (11 µM)於不同時間點之凝膠電泳圖 64
圖3-3.17二維電泳比較Netropsin與distamycin對細菌的影響 65

表目錄 頁次
表1-5.1 歷年來臨床上抗生素之發現 8
表2-3.3. 二維凝膠製備 23
表3-1.1 各個Netropsin衍生物之ΔTm 40
表3-3.1 Distamycin濃度變化&細菌蛋白質影響(下降趨勢) 66
表3-3.2 Distamycin濃度變化&細菌蛋白質影響(上升趨勢) 68
表3-3.3 Distamycin濃度變化&細菌蛋白質影響 70
表3-3.4 (Distamycin 90 µM)時間變化&細菌蛋白質影響 71
表3-3.5. 蛋白質在Dst濃度變化下對應之%Volume 73
表3-3.6. 蛋白質在Dst時間變化下對應之%Volume 74


參考文獻 參考文獻
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