隨著人類基因體計劃的完成，生命科學的研究從基因體學漸漸轉變成蛋白質體學的領域，其中又以蛋白質的修飾及轉錄調控兩部分為主要研究指標。蛋白質的甲基化在這兩部份佔了重要的位置，它是一種常見的轉譯後修飾行為，已知有些蛋白質甲基化扮演重要的細胞調控角色，然而大部分的蛋白質甲基化所產生的功能目前還所知有限，目前依然有許多蛋白質甲基化所需的轉移酶尚未找到。

    啤酒酵母菌( Saccharomyces cerevisiae )的 ABP140 和 NNT1 基因具有甲基轉移酶之特徵序列。本研究為探討 ABP140 和 NNT1 是否具有甲基轉移酶活性及其可能的受質，本研究將啤酒酵母菌中的 ABP140 及 NNT1 基因分別構築到大腸桿菌( Escherichia coli )中，並使其分別表現重組蛋白，利用His-tag融合純化法分別純化出所需之 ABP140 及 NNT1 重組蛋白，並分別以去除 ABP140 及 NNT1 基因的啤酒酵母菌( 以下簡稱 ΔABP140 及 ΔNNT1 )為受質，以具有放射性的S-腺苷甲硫氨酸( S-adenosyl-L-methionine )為輔質來分別測定ABP140 及 NNT1 重組蛋白之活性。利用等電點聚焦電泳( Isoelectric Focusing electrophoresis ; IEF )和十二基硫酸鈉-聚丙烯醯胺膠體電泳( Sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide gel electrophoresis ; SDS-PAGE )方式分離可能受質後，以質譜儀鑑定出其可能受質產物。本研究證實 NNT1 確實具有甲基轉移酶活性，而 ABP140 重組蛋白目前尚無法利用本實驗方法證實其具有甲基轉移酶活性。

As humen genome project is finished, the research of life science has changed its paradigm from genomics to proteomic from genomic gradually. The study of protein modifications and transcriptional regulation has strated to dominate the research head -lines. Protein methylation plays a central role in both of these fields, and it is a post -translation modification of frequent occurrence. Although in many cases the roles of protein methylation are poorly understood, some have been known to play regulatory roles in the cell . Up to now, there are still many protein methyltransferase of protein methylation that remains to be identified .

  The sequences of ABP140 and NNT1 of Saccharomyces cerevisiae match the se -quences of methyltransferase in the database. In this study, we planned to find the activity and substrate of ABP140p and NNT1p. We constructed ABP140 and NNT1 into E. coli to express ABP140p and NNT1p. We used His-tag column to purify ABP140p and NNT1p. The activity is tested by a reaction containing ABP140p and NNT1p, protein extract from ΔABP140 and ΔNNT1 yeast strains and the cosubstrate S-adenosyl-L-methionine of which the methyl being transferred is radioactive. We used isoelectric focusing electrophoresis ( IEF ) and sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) to isolate substrates being methylated. We then used MALDI-TOF to identified the substrates. The result showed the NNT1 is a protein methyltransferase. However our method can not see the activity of ABP140p.

目錄

謝誌……………………………………………….…………………   I
中文摘要…………….…………………….…………………   III
英文摘要…………………………………….…………………   V
縮寫檢索表………………………………………….……………   VI
目錄…………………………………………………….……….  VII
圖、表目錄 …………………………………………………    X
壹、緒論………………………………………………………... 1 
  一、人類基因體計劃及影響……………………………………... 1
  二、蛋白質甲基化作用…………………………………………... 3
  三、研究動機………………………………................... 4
貳、	材料與方法…………………….……………………   7
一、	材料…………………………….……………………... 7
(一)	菌株…………………………..………………………. 7
1.	酵母菌菌種品系………….…………………………… 7
2.	大腸桿菌菌種品系………….………………………… 7
(二)	質體( plasmid )………………………………………….8
(三)	實驗儀器…………………………………………………… 8
二、	方法……………………………………………………….9
(一)	基本實驗策略流程圖………………………………………9
(二)	將啤酒酵母菌中的 ABP140 基因構築到大腸桿菌中並使其表現重組蛋白………………………..…………………..10
1.	萃取啤酒酵母菌 BY4742 菌種的 genomic DNA…...10
2.	引子設計……………………………………………… 11
3.	聚合酶鏈鎖反應………………………………………11
4.	DNA 瓊脂糖膠電泳…………….…………………… 12
5.	純化聚合酶鏈鎖反應之產物……………………….…13
6.	在純化產物兩端加上 Adenosine……….……………13
7.	TA Cloning 酶接反應…………………………………14
8.	勝任細胞製備…………………………………………15
9.	勝任細胞之轉型………………………………………16
10.	質體萃取………………………………………………16
11.	以 EcoRI 限制酶酵素進行確認……………………..17
12.	基因定序………………………………………………18
(三)	 將 ABP140 基因，由 pGEM-T Easy Vector 中構築到表現載體 pET28c 中…………………………..……………18
1.	酶切反應( Digestion )……………………..…………19
2.	酶接反應( Ligation )……………………………………19
3.	以酶切反應確認基因是否接入表現載體……………20
(四)	 ABP140 及 NNT1 重組蛋白質表現與純化……………21
1.	重組蛋白質表現………………………………………21
2.	超音波破菌 ( Sonication)……………………..………21
3.	His-tag 融合純化法純化重組蛋白……………………22
4.	離子交換色層分析法純化蛋白質.……………………23
(1)	Mono QTM 5/50 GL column 架設及準備工作……24
(2)	樣品注射、樣品純化………………………………24
(3)	Mono QTM 5/50 GL column 清洗及保存…………25
(五)	測定 ABP140 及 NNT1 重組蛋白之其甲基轉移酶活性及分析其受質………………………………..………………25
1.	受質的製備……………………………………………25
2.	放射線甲基轉移反應…………………………………26
3.	以 SDS-PAGE 初步測定甲基轉移酶活性……………27
4.	利用等電點聚焦蛋白質電泳以等電點分離受質……28
5.	利用 SDS-PAGE 蛋白質電泳以分子量來分離受質...29
6.	以質譜儀分析可能受質………………………………30
參、	結果與討論…………………………………………..32
肆、	結論…………………………………………………. 41
伍、	圖與表…………………………………………………….42
陸、	參考文獻………………………………………………….67


圖、表目錄

表1 : ABP140 基因的聚合酶鏈鎖反應條件………..………………42
表2 : ABP140p 和其受質實驗反應方式列表……………………….43
表3 : NNT1p 和其受質實驗反應方式列表…………………………44

圖1 : 基本實驗策略流程圖………………………………….………45
圖2: 經Taq DNA polymerase + Pfu DNA polymerase ( 16 : 1 )的 PCR 方式增殖出且經由補A、純化後的ABP140 基因片段……….…46
圖3 : 以限制酶 EcoRI 進行酶切反應來確認出正確接入 ABP140 基因片段的 pGEM-T Easy Vector……………..………………………47
圖4: ABP140 定序比對結果圖……………………………………..48
圖5: 利用限制酶 EcoRI、NheI 分別對含有 ABP140 基因片段的 pGEM-T Easy Vector 和原始不含任何殖入基因的 pET28c 表現載體進行酶切反應……………..………………………………………51
圖6 : 以限制酶 EcoRI、NheI 進行酶切反應來確認出正確接入 ABP140 基因片段的 pET28c 表現載體…..………………………52
圖7 : 利用 His-Tag 融合法純化ABP140p………………………53
圖8 : 利用 His-Tag 融合法純化NNT1p…………………………54
圖9 : 以SDS-PAGE 蛋白質電泳分析 ABP140 甲基轉移酶活性測試之放射線感應底片結果………………………..…………………55
圖10 : NNT1 甲基轉移酶活性測試之放射線感應底片結果……..…56
圖11 : 以 3 ~ 10 pI 值範圍的IEF 蛋白質電泳分析 ABP140p　甲基轉移酶活性的放射線感應底片結果…………………………………57
圖12 : 以 3 ~ 10 pI 值範圍的IEF 蛋白質電泳分析 NNT1p 甲基轉移酶活性的放射線感應底片結果……………………………………58
圖13 : 以 8 ~ 10.5 pI 值範圍的 IEF 蛋白質電泳分離甲基轉移反應的反應物之放射線感應底片結果…………….…………………….59
圖14 : NNT1 利用SDS-PAGE電泳分離受質之放射線感應底片結果結果………………………..…….……………………………………..60
圖15 : ( a ) 兩種反應物 ( Hot-SAM 反應和Cold-SAM 反應的反應物) 在同一個膠片上但是不同 lane 方式來先進行 8 ~ 10.5 pI 值範圍的IEF 蛋白質電泳的放射線感應底片結果。 ( b ) 對照已經顯像的放射線感應底片將可能反應條帶由膠上切下後的膠片圖。………………………………………………………………………61
圖16 : 利用 His-Tag 融合法純化pET28p…………………………62
圖17 : 以Mono QTM 5/50 GL column 二次純化NNT1p的純化結果.63
圖18 : 以Mono QTM 5/50 GL column 純化二次純化NNT1p ，並將所收集的液體以 SDS-PAGE 蛋白質電來確認二次純化的狀況...……64
圖19 : His-tag 融合純化法純化 E1部份的 NNT1p 、His-tag 融合純化法純化 E1部份的pET28p 、 NNT1p 二次純化的第 14 管 、 NNT1p 二次純化的第 17 管來做放射線甲基轉移反應的SDS-PAGE 蛋白質電泳的放射線感應底片結果……..……………………….65
圖20 :  His-tag 融合純化法純化 E1部份的 NNT1p 、His-tag 融合純化法純化 E1部份的pET28p 、 NNT1p 二次純化的第 14 管 、 NNT1p 二次純化的第 17 管來做放射線甲基轉移反應的 8 ~ 10.5 pI 值範圍的 IEF 蛋白質電泳的放射線感應底片結果…………….66

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