I.啤酒酵母菌（ Saccharomyces cerevisiae ）的開放讀碼框 YJR129Cp 具有甲基轉移酶之特徵序列，且在資料庫中與幽門螺旋菌（ Helicobacter pylori ）的核糖體蛋白L11甲基轉移酶最為相似，因此本研究以假設性甲基轉移酶 YJR129Cp為酵素，透過 ΔYJR129Cp 之全細胞粗抽蛋白質為受質，以及二維電泳原理，找出 YJR129Cp 在啤酒酵母菌細胞中的受質，目前在本研究以初步蛋白質鑑定此甲基化受質為 Elongation Factor 2(EF-2) 之後會純化出此蛋白質以確定此假設性甲基化受質EF-2是否為YJR129Cp之甲基化受質。並在確定受質後希望進一步分析 YJR129Cp 甲基轉移酶將受質甲基化修飾所具有的生理意義。

另外在本研究中，透過分別進行等電點聚焦電泳以及SDS-PAGE分析，因此我們可以集中大量的等電點聚焦電泳分析後之凝膠條帶，再將其條帶中含有的蛋白質析出濃縮後再進行SDS-PAGE分析，如此儘管為微弱曝光也不會因為二維電泳而導致曝光程度不夠，另外也可集中大量的蛋白質樣品以利於蛋白質鑑定。

II.在之前學長的研究重組酵母菌醛類去氫酶 ALD6p 並轉型至大腸桿菌( Escherichia coli )的表現載體 BL21，以達到大量誘導表現重組蛋白之目的。但由於之前一直存在目標蛋白質降解之問題，故我們透過降低培養時的溫度以改善目標蛋白質降解問題。另外也利用陰離子交換樹脂Q SepharoseTM Fast Flow ( Amersham Biosciences )採用反向吸入欲純化之樣品，正向洗出雜蛋白質並搭配目標蛋白質pI之適當 pH 值的 Buffer 以達到一步純化( one-step purification )之目的。

I.The ORF of YJR129Cp of S. cervisiae has a close match with the methyltransferase in database, therefore, in this research the putative methyltransferase YJR129Cp is used as enzyme to find the substrate of YJR129Cp of S. cervisiae by means of the substrate of ΔYJR129Cp of cell lysate as well as 2-D electrophoresis procedure.

Thus far, the translation factor 2 (EF-2) has been identified as a methylation substrate forYJR129Cp in S. cervisiae by proteomics analysis. Afterward, EF-2 will be purified to make sure the substrate of putative methyltransferase YJR129Cp. Also, after it is confirmed we want to analyze further that methyltransferase YJR129Cp methylates substrate in a way with the physiological significance. 

On the other hand, this research is proceeded with isoelectric focusing (IEF) and SDS-PAGE in a separate manner. For this reason, we are able to congregate a large quantity of focus bands after IEF is analyzed. And we can extract protein from some of them and then concentrate the protein to carry out SDS-PAGE. In this way, even though they are only lightly exposed, the exposed focus bands are still enough by combination of multiple bands. Therefore, we can gather a plenty of protein samples to benefit proteomics analysis.


II.In the previous research the recombinant ALD6p of S. cervisiae has been overexpressed in E. coli strain. However, the degradation problem persisted. We solved this problem by way of decreasing the temperature of induction. Moreover, we used Q SepharoseTM Fast Flow ( Amersham Biosciences ) and reversed the flow direction of elution relative to that of sample loading, and also referred to ALD6p pI value to select for suitable buffer pH to fulfill the purpose of one-step purification.

目錄

謝誌                                            I
中文摘要                                        II
英文摘要                                        III
目錄                                            V
表目錄                                          VIII
圖目錄                                          IX
簡字表                                          XII

第一部分   酵母菌假設性甲基轉移酶YJR129c蛋白質受質之鑑定分析

第一章	  緒論-------------------------------------------------- 1

第二章	  利用IEF 將 YJR129Cp之受質分離
第一節	前言 ---------------------------------------------- 2
第二節	實驗器材與藥品 ------------------------------- 2
第三節	實驗步驟
2.3.1	YJR129Cp 酵素純化 -------------------- 5
2.3.2	利用 IEF 分離 YJR129Cp 受質 ---- 6
2.3.3	將電泳完的膠片進行乾膠壓片 -------- 7
第四節  結果分析 ---------------------------------------- 8
2.4.1	培養 YJR129Cp 蛋白質與純化酵素 – 8
2.4.2	利用純化 YJR129Cp 酵素作甲基化反應
並進行 IEF 分離 ------------------------- 9

第三章	  YJR129Cp 之受質鑑定
第一節 前言-------------------------------------------------- 23
第二節 實驗器材與藥品 --------------------------------- 25
第三節 實驗步驟
3.3.1利用 IEF 將YJR129Cp 甲基化酵素
之受質分離 ------------------------------- 25
3.3.2將 IEF 分離的YJR129Cp 甲基化酵素
之受質再經由SDS 分離 -------------- 25
            3.3.3將經由二維電泳原理分離的YJR129Cp 
甲基化受質作質譜分析鑑定 ---------- 26



第四節 結果分析 
3.4.1利用 IEF 將甲基轉移酶酵素 YJR129Cp 
之受質分離 ------------------------------- 26
3.4.2將 IEF 分離後的樣品再進行 SDS 
分離 ---------------------------------------- 27
3.4.3利用二維電泳原理所分離出甲基轉移酶 YJR129Cp 
之受質鑑定結果 ------------------------- 27

第四章	  總結與討論 ------------------------------------------ 32
       未來研究計畫 ------------------------------- 33

參考文獻 ------------------------------------------------ 35


第二部份 重組酵母菌醛類去氫酶ALD6p之非降解表現與一步純化

第一章	  緒論 ----------------------------------------------- 37
第二章	  重組酵母菌醛類去氫酶 ALD6p 之非降解表現
第一節	 前言 ---------------------------------------------- 41
第二節	 實驗器材與藥品 ------------------------------- 41
第三節	 實驗步驟 
3.1.1	菌種培養 ---------------------------------- 43
3.1.2	破碎菌體並進行SDS – PAGE 
電泳分析 ---------------------------------- 43
第四節	 結果分析 ----------------------------------------- 44

第三章	  ALD6p 為對象利用倒沖方式確定緩衝溶液之pH 值影響
  第一節 前言 ----------------------------------------------- 46
  第二節 實驗器材與藥品 -------------------------------- 48
  第三節 實驗步驟
         3.3.1 菌種培養 --------------------------------- 50
         3.3.2破碎菌體 ---------------------------------- 50
         3.3.3沉澱細胞粗抽物中的蛋白質 ---------- 50
         3.3.4重組蛋白 ALD6p 純化之條件設定 – 50
3.3.5	目標蛋白質之純化 ---------------------- 51
3.3.6	SDS-PAGE 分析純化產物
以及比活性測定 ------------------------- 51
第四節 結果分析 ------------------------------------------ 52



第四章	  ALD6p 為對象利用倒沖方式確定樣品濃度對純化的影響
第一節 前言 ---------------------------------------------- 63
第二節 實驗器材與藥品 ------------------------------- 63
第三節 實驗步驟 ---------------------------------------- 63
第四節 結果分析 ---------------------------------------- 63

第五章	  總結與討論--------------------------------------- 69

參考文獻 --------------------------------------------- 71

附錄 一 

   Chen M.K.,Shiah W.J.,Chen J.J.,Tsai T.Y.,Lin H.Y.,Liu C.W.,(2009) Single-step protein purification by back flush in ion exchange chromatography. Analytical Biochemistry--------------------------------------- 73

表目錄


第一部分   酵母菌假設性甲基轉移酶YJR129c蛋白質受質之鑑定分析

表 2.1   甲基化反應所添加樣品之成分表 -------------------------------------- 22

表 2.1   甲基化反應所添加樣品之成分表 -------------------------------------- 22

表 2.3   等電點具焦電泳時間與伏特設定 -------------------------------------- 7


第二部份 重組酵母菌醛類去氫酶ALD6p之非降解表現與一步純化

表 1.1   酵母菌的 Aldehyde dehydrogenase 家族 -------------------------- 40

表 3.1   活性測定時在塑膠比色槽中加入成分比例 ------------------------- 51

表 3.2   目標重組蛋白質 ALD6p 在經過兩次的純化 
( Q SepharoseTM Fast Flow 、 Blue SepharoseTM Fast Flow )
過程所測得的純化表 --------------------------------------------------- 55

表 3.3   純化目標重組蛋白質 ALD6p 利用Q SepharoseTM Fast Flow 
純化所測得的活性及比活性 。( 純化條件 : buffer pH 7.6 ) --60

表 3.4   純化目標重組蛋白質 ALD6p 利用Q SepharoseTM Fast Flow 
純化所測得的活性及比活性 。( 純化條件 : buffer pH 6.0 ) --61

表 3.5   純化目標重組蛋白質 ALD6p 利用Q SepharoseTM Fast Flow 
純化所測得的活性及比活性 。( 純化條件 : buffer pH 8.8 ) --62

表 4.1   利用不同濃度的蛋白質菌液進行純化並且定量以了解
Homogeneous 占總蛋白質的比例 ----------------------------------68





圖目錄

第一部分   酵母菌假設性甲基轉移酶YJR129c蛋白質受質之鑑定分析


圖2.1      BL21 ( DE3 ) / pET28 – YJR129Cp 培養24小時 、 18 ℃ ----- 11

圖2.2 – A   BL 21 ( DE3 ) / pET28 – YJR129Cp 利用
BD TALON™ Metal Affinity Resins 純化結果 --------------------------------------------------------------------------------- 12

圖2.2 – B   BL21 ( DE3 ) / pET 28利用BD TALON™ Metal 
Affinity Resins 純化結果 --------------------------------------------------------------------------------- 12

圖2.3      確定YJR129Cp之受質為等電點聚焦電泳pH 5~8的條帶位置 13


圖2.4      將上述的圖2.1反白比較純化的情形 -------------------------------- 14

圖2.5 - A    BL 21 ( DE3 ) / pET28 – YJR129Cp 利用Mono QTM 5/50 GL ( Tricorn ) 純化結果 --------------------------------------------------- 15

圖2.5 – B   BL 21 ( DE3 ) / pET28 利用Mono QTM 5/50 GL ( Tricorn ) 
純化結果 ------------------------------------------------------------------- 15

圖 2.6      BL21 ( DE3 ) / pET28 – YJR129Cp經由Mono QTM
 5/50 GL ( Tricorn ) 純化後針對 OD280nm的層析圖 ----------------------------- 16

圖2.7      將上述圖 2.5 中Buffer B % 25 ~ 50的部分再細分成
四個部分確認甲基轉移酶 YJR129Cp 在梯度的純度最高 -------------------------------------------------------------------------------- 17


圖2.8      確定YJR129Cp之受質為等電點聚焦電泳pH 5~8的
條帶位置 ------------------------------------------------------------------- 18

圖 2.9     利用甲基轉移酶 YJR129Cp 作甲基化反應所得產物
進行SDS 分析 ----------------------------------------------------------- 19

圖2.10     將圖2.8的IEF膠片在切除分成六部分並萃取蛋白--------------- 20


圖 2.11    將圖 2.10 所萃取出的蛋白質進行 SDS 電泳確定IEF膠片上
曝光處為EF – 2 ------------------------------------------------------------21

圖 3.1     基本實驗流程圖 ----------------------------------------------------------- 24

圖 3.2     培養ΔYJR129Cp 至OD600nm > 2時以 甲基轉移酶 YJR129Cp 
作甲基化反應後進行 IEF 分析 --------------------------------------- 28

圖3.3      利用具有放射性的S - 腺苷 – L - 甲硫胺酸 ( Hot-SAM ) 以及
不具放射性的S - 腺苷 – L - 甲硫胺酸 ( Cold-SAM ) 與 
YJR129Cp 和 ΔYJR129Cp 進行體外( in vitro )之甲基化反應，
之後取反應物進行等電點聚焦電泳 pH 5~8。--------------------------------------------------------------------------------- 29

圖3.4      將經由 IEF 分離分析所標定位置之條帶給切下，並利用 0.3M (NH4)HCO3 和 0.5%SDS 溶液以萃取出膠片上的蛋白質；
並進行SDS-PAGE電泳分析。---------------------------------------- 30

圖 3.5     委託明欣生物科技公司(Mission Biotech)作
蛋白質鑑定後所得之資料------------------------------------------------ 31



第二部份 重組酵母菌醛類去氫酶ALD6p之非降解表現與一步純化


圖 1.1     酵母菌 S.cerevisiae 的 PDH by - pass ----------------------------- 39

圖 2.1     各種溫度下的 ALD6p 誘導表現情形 ----------------------------- 45

圖3.1      基本實驗流程 ----------------------------------------------------------- 47

圖 3.2     一般的方式利用Q SepharoseTM Fast Flow
純化ALD6p 蛋白質 -------------------------------------------------- 54

圖 3.3     將進行第一次純化後的蛋白質 Fraction 進行第二次純化
Blue SepharoseTM Fast Flow ------------------------------------------- 55

圖 3.4     於Q SepharoseTM Fast Flow純化後進行
SDS-PAGE，所使用Buffer pH7.6 ---------------------------------- 56

圖 3.5     於Q SepharoseTM Fast Flow純化後進行
SDS-PAGE，所使用Buffer pH6.0 ---------------------------------- 57

圖 3.6     於Q SepharoseTM Fast Flow純化後進行
SDS-PAGE，所使用Buffer pH8.8 ---------------------------------- 58

圖 4.1    利用200 mL 菌液離心破菌後進行
Q SepharoseTM Fast Flow 純化 -------------------------------------- 65

圖 4.2    利用100 mL 菌液離心破菌後進行
Q SepharoseTM Fast Flow 純化 ------------------------------------- 66

圖 4.3    利用50 mL 菌液離心破菌後進行
Q SepharoseTM Fast Flow 純化 ------------------------------------- 67

I.
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