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系統識別號 U0002-2706200717482900
中文論文名稱 啤酒酵母菌之電穿孔高效率轉型及其在酵母菌雙雜合篩選之應用
英文論文名稱 High-efficient transformation of Saccharomyces cerevisiae by electroporation: application to yeast two-hybrid screening
校院名稱 淡江大學
系所名稱(中) 生命科學研究所碩士班
系所名稱(英) Graduate Institute of Life Sciences
學年度 95
學期 2
出版年 96
研究生中文姓名 林昕瑩
研究生英文姓名 Hsin-Ying Lin
學號 694290106
學位類別 碩士
語文別 中文
口試日期 2007-06-05
論文頁數 90頁
口試委員 指導教授-陳銘凱
委員-莊子超
委員-林賜恩
中文關鍵字 啤酒酵母菌  電穿孔法  酵母菌雙雜合篩選 
英文關鍵字 electroporation  yeast two-hybrid screening 
學科別分類 學科別醫學與生命科學生物學
中文摘要 在第一部份是關於電穿孔法高效率轉型,由六個不同的基因YJR129C、YHR209W、EBNA2、shy A、NBS1及KPNA2去探討一些會影響轉型效率的變因,像是在培養基的製備、轉入質體DNA的預處理及轉入不同質量的質體DNA等。之後把高效率電穿孔法應用在酵母菌雙雜合篩選上,目的是藉由此法使酵母菌雙雜合的轉型達到更理想的效率,以利於由基因庫中,轉型的細胞數目能夠涵蓋完整的基因組。此步驟效率已達到2.5 x 106 /μg DNA。
第二部分應用高效率電穿孔法於酵母菌的雙雜合篩選,以「魚、餌」的概念,由已知的基因YJR129C、YHR209W、EBNA2接上BD載體,做為「餌」,YJR129C、YHR209W各為啤酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae) BY4742上的一段基因,為假設性甲基轉移酶。EBNA2為EB病毒感染細胞後最先表現的基因之一,也是促使B細胞不死化的重要因子;再由已接上AD載體之未知目標基因之基因庫,為「魚」。送入啤酒酵母菌PJ69-4A中,有兩兩有結合的蛋白質就會在篩選的特定培養基中表現出來。之後,我們可以再把未知的目標基因做進一步的功能性分析,可以瞭解到各個蛋白之功能與特性。目前在EBNA2的酵母菌雙雜合篩選實驗中,所篩選出菌落數為421株。
英文摘要 In part I, high efficiency transformation by electroporation is developed. Factors such as medium preparation, pretreatment of plasmid, quantities of plasmid, are investigated with six different genes YJR129C, YHR209W, EBNA2, shy A, NBS1 and KPNA2. The purpose of our protocol is to achieve ideal efficiency so that the number of transformants can saturate the library used in two-hybrid screening. This protocol has reached a efficiency of more than 2.5 x 106 /μg DNA.
In part II, high efficiency transformation by electroporation is applied to yeast two-hybrid screening. Using a “fish-bait” concept, known genes YJR129C, YHR209W, EBNA2 are ligated to the BD vector as “the bait”. YJR129C and YHR209W are from Saccharomyces cerevisiae BY4742, both a putative methyltransferase gene. EBNA2 is one of the early expressed genes during EB virus infection, important in promoting the B cell immortalization. Appropriate DNA library constructed in the AD vector was screened for “the fish” when the library was transformed into yeast, PJ69-4A. The interacting proteins expressed from the library would be selected in the specific medium. Afterwards, more functional analysis may be done to understand role of the genes being selected and the characteristics of the protein product. In the EBNA2-interacting protein using the yeast two-hybrid screening, 421 positive clones were obtained.
論文目次 目錄
謝 誌 …………………………………………………………… I
中文摘要 …………………………………………………………… II
英文摘要 …………………………………………………………… III
縮 寫 表 …………………………………………………………… IV
目 錄 …………………………………………………………… V
圖表目錄 …………………………………………………………… X

第一部份 酵母菌Saccharomyces cerevisiae高效率轉型
第一章 序論 ……………………………………………………… 1
第一節 酵母菌之簡介 ………………………………………… 1
第二節 電穿孔之介紹 ………………………………………… 1
第三節 研究動機 ……………………………………………… 2
第二章 實驗材料與方法 ………………………………………… 5
第一節 重組DNA製備 ………………………………………… 5
1-1 抽取酵母菌genomic DNA:BY4742 ………………… 5
1-2 聚合酶鏈鎖反應大量複製目標基因-YHR209W……… 7
1-3 瓊脂凝膠電泳分析PCR產物 ………………………… 8
1-4 溶膠純化PCR產物 …………………………………… 9
1-5 PCR產物片段補adenine …………………………… 10
1-6 基因選殖-TA- cloning ………………………………… 11
1-7 大腸桿菌DH5α勝任細胞之配製—氯化鈣法 ……… 12
1-8 大腸桿菌之質體轉型 ………………………………… 14
1-9 少量質體DNA的製備 ………………………………… 15
1-10 利用限制酶處理確認質體DNA-pGEM-T-YHR209W 17
1-11 定序 …………………………………………………… 18
1-12 建構選殖基因之限制酶切位 ……………………… 19
1-13 選殖基因YHR209W與表現載體pGBDU C-1之接
合 ……………………………………………………… 21
1-14 轉型至DH5α ………………………………………… 21
1-15 利用限制酶確認片段以篩選正確之質體 DNA …… 22
第二節 酵母菌轉型 …………………………………………… 24
2-1 小量酵母菌轉型(第一次轉型)………………………… 24
2-2 電穿孔法轉型—Sorbitol方法(第二次轉型)………… 27
2-3電穿孔法轉型—PEG+熱休克方法(第二次轉型)……………………………………………………… 30
第三章 結果與討論 ……………………………………………… 33
第一節 重組DNA製備 ………………………………………… 33
1-1 聚合酶鏈鎖反應結果 ………………………………… 33
1-2 TA-cloning確認結果 …………………………………… 34
1-3 建構選殖基因之限制酶切位確認結果 ……………… 35
1-4 確認接合後之產物 …………………………………… 36
第二節 酵母菌轉型 ……………………………………………
2-1 兩種不同電穿孔實驗步驟比較 ……………………… 37
2-1.1 PEG4000和熱休克 ………………………………… 37
2-1.2 醋酸鋰、DTT和sorbitol ………………………… 38
2-2 配置培養基時葡萄糖的處理 ………………………… 39
2-3 培養基上有無sorbitol ………………………………… 41
2-4 Sorbitol會不會影響蛋白質與蛋白質間的交互作用力 ……………………………………………………… 42
2-5 轉入的質體DNA之處理 ……………………………… 46
2-6 不同質量的比較 ……………………………………… 48
2-7 有加入和沒加入ssDNA的差別 ……………………… 51
第四章 結論………………………………………………………… 53

第二部分 酵母菌雙雜合之應用
第一章 序論 ……………………………………………………… 54
第一節 酵母菌雙雜合之介紹…………………………………… 54
第二節 伊波病毒核抗原-2之介紹 …………………………… 56
第三節 實驗動機 ……………………………………………… 57
第二章 實驗材料與方法…………………………………………… 58
第一節 伊波病毒核抗原-2之第二次酵母菌轉型篩選 ……… 58
1-1 大量酵母菌轉型 ……………………………………… 58
1-2 轉盤 …………………………………………………… 61
1-3 抽取酵母菌genomic DNA ………………………… 62
1-4 大腸桿菌DH5α勝任細胞之配製--電破轉型法 ……… 63
1-5 大腸桿菌之質體轉型--電破轉型法 …………………… 64
1-6 質體DNA的製備 ……………………………………… 65
1-7 利用限制酶處理確認質體DNA ……………………… 67
1-8 定序 …………………………………………………… 68
第三章 結果與討論………………………………………………… 69
第一節 伊波病毒核抗原-2之第二次酵母菌轉型篩選 ……… 69
1-1 轉型達到之效率………………………………………… 69
1-2 長出顆數 ……………………………………………… 70
1-3 轉盤過程 ……………………………………………… 71
1-4 以限制酶Hind III處理確認結果 ……………………… 74
1-5比對篩選出之基因結果 ………………………………… 75
第四章 結論………………………………………………………… 78

參考文獻 …………………………………………………………… 79

附錄一、Single-stranded carrier DNA 製備 ……………………… 82
附錄二、pGEM-T Easy Vector之特徵圖 ………………………… 84
附錄三、Dropout powder 的營養成分及濃度表 ………………… 85
附錄四、pACT載體之特徵圖 …………………………………… 86
附錄五、pGBDU-C(X)載體與pGAD-C(X)載體之特徵圖 ……… 87
附錄六、DNA ladder對照濃度圖………………………………… 88
附錄七、實驗儀器…………………………………………………… 89








圖表目錄
圖一、YHR209W之PCR結果 …………………………………… 33
圖二、YHR209W與pGEM-T Easy Vector用限制酶確認之結果… 34
圖三、insert YHR209W與pGBDU C-1 Vector用限制酶處理結果. 35
圖四、YHR209W與pGBDU C-1 Vector接合完後用限制酶確認. 36
圖五、EBNA2在固體培養基的表現比較含sorbitol之差異 …… 41
圖六、shy A在固體培養基的表現比較含sorbitol之差異 ……… 43
圖七、shy A 在SC-Ura/-Leu與SC-Ura/-Leu/-Ade培養基的表現. 43
圖八、NBS1在SC-Ura/-Leu/-Ade培養基的表現比較含sorbitol之差異 ……………………………………………………… 45
圖九、NBS1在SC-Ura/-Leu培養基的表現比較含sorbitol之差異. 45
圖十、不同的重組基因轉入不同質量的質體DNA表現轉型效率的曲線圖 …………………………………………………… 49
圖十一、酵母菌雙雜合示意圖 …………………………………… 55
圖十二、EBNA2全長及去除AD片段的示意圖 ………………… 57
圖十三、pACT載體,以限制酶Hind III作用之切為示意圖…… 68
圖十四、把表現之菌落轉盤至SC-Ura/-Leu/-Ade之固態培養基. 71
圖十五、把菌落轉盤至SC-Ura/-Leu之固態培養基 …………… 72
圖十六、把菌落轉盤至SC-Leu之固態培養基 …………………… 73
圖十七、把菌落轉盤至SC-Leu+5-FOA之固態培養基 ………… 73
圖十八、用限制酶確定所要之質體DNA,編號:353.359.362.364. 74
圖十九、用限制酶確定所要之質體DNA,編號:165.168.170… 75
圖二十、編號355的blast示意圖 ………………………………… 76


表一、YHR209W之PCR反應表 ………………………………… 8
表二、PCR反應溫度與設定 ……………………………………… 8
表三、配製補adenine之反應溶液 ………………………………… 11
表四、與TA- cloning接合反應之溶液 …………………………… 12
表五、利用限制酶處理確認之反應條件 ………………………… 18
表六、用Pst I限制酶切割之反應條件 …………………………… 20
表七、用BamHⅠ限制酶切割之反應條件………………………… 20
表八、選殖基因YHR209W與表現載體pGBDU C-1之接合條件. 21
表九、用Pst I限制酶切割之反應條件確認接合 ………………… 22
表十、用BamHⅠ限制酶切割之反應條件確認接合 …………… 22
表十一、葡萄糖與培養基混合滅菌及分開各別滅菌的比較 …… 39
表十二、shy A轉型後在不同培養基所表現的顆數及效率……… 42
表十三、NBS1轉型後在不同培養基所表現的顆數及效率……… 44
表十四、NBS1與shy A之轉型DNA處理前後的比較 ………… 47
表十五、以不同的重組基因去比較不同質量的質體DNA的差異對轉型效率的影響 ……………………………………… 48
表十六、以不同的重組基因去比較有加入和沒加入ssDNA的差異對轉型效率的影響 …………………………………… 51
表十七、利用限制酶Hind III處理確認質體DNA反應條件…… 67
表十八、EBNA2轉型效率、次數及顆數的結果呈現 …………… 69
表十九、EBNA2長出顆數分佈表………………………………… 70
表二十、回推正確基因名稱及資料庫編號的結果 ……………… 76




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