淡江大學覺生紀念圖書館 (TKU Library)
進階搜尋


系統識別號 U0002-2507200517195500
中文論文名稱 乳酸菌α-半乳糖水解酵素之純化與鑑定
英文論文名稱 Purification and Characterization of α-D-Galactosidase from Lactobacillus sporogenes
校院名稱 淡江大學
系所名稱(中) 化學學系碩士班
系所名稱(英) Department of Chemistry
學年度 93
學期 2
出版年 94
研究生中文姓名 陳奕任
研究生英文姓名 Yi-Jen Chen
學號 692171068
學位類別 碩士
語文別 中文
口試日期 2005-06-15
論文頁數 82頁
口試委員 指導教授-簡素芳
委員-張可中
委員-王啟銘
中文關鍵字 α-半乳糖水解酵素  芽胞乳酸菌  快速蛋白質液相層析法  血型轉換  紅血球細胞 
英文關鍵字 α-D-Galactosidase  Lactobacillus sporogenes  FPLC  conversion  erythrocyte 
學科別分類 學科別自然科學化學
中文摘要 本實驗以基因工程的方法,將稻米α-galactosidase基因接到質
體上(pLDHEB),並轉殖入乳酸菌(Lactobacillus sporogenes)表現出較多的α-半乳糖水解酵素。經由大量製備純化後予以定性和定量分析,並測試B型紅血球轉變為O型紅血球之情形。
在最佳條件下培養乳酸菌,並利用超音波細胞破碎後,1升的菌液可以得到1.2 g、40單位的粗製蛋白質。再由液相層析方法使用分子篩管柱層析(Sephadex G-150、Sephacryl S-100)、陰離子交換樹脂(DEAE Sepharose FF)與疏水性管柱層析(Phenyl Sepharose FF)等
過程純化,經由這4種管柱之總純化倍率為955倍,回收率為69%,比
活性為44.9 units/mg。
在定性分析方面,由SDS-PAGE與Native PAGE判斷α-半乳糖水解酵素
之分子量為60 KDa;其最適合的pH值為7.7;對pH值之穩定性在6.4 ~ 8.7;在45°C以下對熱較為穩定。
在一般測試的情況下,以0.3 unit的純化酵素在1小時可將70%的B型紅血球轉為O型紅血球。我們的最終目標是要能有更好的酵素將紅血球完全的轉型才可以用於輸血。
英文摘要 By way of gene cloning method, we have cloned the rice α-Galactosidase gene into a vector(pLDHEB) and transformed into Lactobacillus sporogenes.The transformant which contains a gene encoded forα-Galactosidase was cultured at 30°C in TSB medium. α-Galactosidase was expressed intracellularly. We obtained 40-60 units per liter of culture, without secreted protein was observed. Six-hour culture was centrifuged andsonicated in order to break the cell. The enzyme was extracted and concentrated.
We use the AKTA FPLC system to purify the enzyme. This apparatus was used for gel filtration(Sephacryl S-100)、ion exchange(DEAE Sepharose) and hydrophobic interaction(Phenyl Sepharose)column chromatographies. It results in 955 folds of purification with 69% recovery and 44.9 unit/mg of specific activity.
From SDS-PAGE, enzyme protein shows as a major band.Its molecular weight is estimated about 60KDa. For native gel,a yellow band shows that the enzyme activity truly exist. The pH optimum of enzyme is at pH7.7; it is stable at pH between 6.4-8.7 and rather stable at the temperature below 45°C.
For enzyme conversion of B red blood cells into O red blood cells, under the standard testing condition, it reveals that it could convert about 70% of B erythrocytes into group O cells. Our goal is to make that total conversion in order to make transfusion in human.
論文目次 中 文 摘 要 I
英 文 摘 要 II
總 目 錄 III
圖 表 目 錄 IV

第一章 緒 論 1
1.1 α-半乳糖水解酵素 1
1.2 早期發現α-半乳糖水解酵素之晶狀及其性質 3
1.3 法布瑞氏症是α-半乳糖酵素的缺乏症 4
1.4 人類的血型 5
1.5 人體紅血球細胞的表面抗原 6
1.6 已經發表血型轉換之論文 8
1.7 芽孢乳酸菌 10
1.8 研究目的 12
第二章 儀器與藥品 15
第三章 實驗部分 16
3.1 重組質體與乳酸菌的轉殖 16
3.1.1 α-半乳糖水解酵素基因的取得 16
3.1.2 建構pSDER和pLDHEB質體 16
3.1.3 轉殖[利用電導(electroporation)] 18
3.1.4 菌落的篩選 18
3.1.5 α-半乳糖水解酵素之基因表現 18
3.2 細菌的培養條件 18
3.2.1 固體培養基製作 18
3.2.2 液體培養基製作 19
3.2.3 培養條件-溫度調控 19
3.2.4 培養條件-容器大小(與瓶中的含氧量有關)21
3.2.5 最佳條件下α-半乳糖水解酵素的表現 23
3.3 α-galactosidase的萃取與純化 24
3.3.1 細胞破碎 24
3.3.2 蛋白質純化 25
3.4 酵素的定量與定性分析 31
3.4.1 蛋白質電泳 31
3.4.2 蛋白質定量法-Bradford Method 35
3.4.3 酵素活性單位 36
3.4.4 酵素的最佳pH值與穩定性 37
3.4.5 酵素的熱穩定性 38
3.4.6 各類鹽溶液之濃度對酵素活性的影響 39
3.5 血型轉換 39
第四章 結果與討論 42
4.1 最佳化之培養條件 42
4.1.1 調控溫度37°C、30°C、23°C 42
4.1.2 適當的養菌容器與培養基之體積 45
4.1.3 乳酸菌胞內表現酵素結果 50
4.1.4 乳酸菌胞外分泌酵素結果 51
4.2 α-半乳糖水解酵素的特性 51
4.3 胞內與胞外純化酵素之血型轉換結果 52
第五章 總結與未來展望 78
第六章 參考資料 81

圖表目錄
表1.1 國際生化及分子生物學會的α-半乳糖水解酵素之命名 1
表1.2 利用不同受質濃度與酵素反應,在酵素動力學中計算出α-半
乳糖水解酵素催化速率與Km值 3
表1.3 醣類對於α-半乳糖水解酵素抑制能力 4
表1.4 大豆與酵母菌之α-半乳糖水解酵素的差異性 10
表1.5 Bacillus、Lactobacillus、Sporolactobacillus
與Lactobacillus sporogenes的差異性 12
表3.1 細胞破碎的方法 24
表4.1 37°C、30°C、23°C試管培養之菌生長情形 42
表4.2 乳酸菌表現α-半乳糖水解酵素的純化總表 63

圖1.1 相異的生物體所表現的α-半乳糖水解酵素結構
(經X-ray鑑定) 2
圖1.2 人體血液中的血漿與紅血球 6
圖1.3 A、B、H抗原結構 7
圖1.4 水解A、B抗原末端的糖基成為H抗原 8
圖1.5 芽孢乳酸菌之構造 11
圖1.6 實驗室利用基因工程方法的流程圖 13
圖3.1 乳酸菌表現質體pLDHEB 17
圖3.2 液相層析之膠體結構 26
圖4.1 玻璃試管之菌生長與酵素表現圖示 46
圖4.2 血清瓶之菌生長與酵素表現圖示 47
圖4.3 錐形瓶之菌生長與酵素表現圖示 49
圖4.4 乳酸菌於培養皿養菌與篩選 53
圖4.5 37、30、23°C中培菌之菌體SDS-PAGE 55
圖4.6 乳酸菌生長及酵素表現結果 57
圖4.7 表現蛋白(胞內)經分子篩(G-150)液相層析管柱 59
圖4.8 表現蛋白(胞內)經離子交換(DEAE)液相層析管柱 60
圖4.9 表現蛋白(胞內)經疏水性(phenyl)液相層析管柱 61
圖4.10 表現蛋白(胞內)經分子篩(S-100)液相層析管柱 62
圖4.11 酵素定性分析 64
圖4.12 乳酸菌表現酵素之熱穩定性 65
圖4.13 各類溶液濃度對於酵素活性的影響 66
圖4.14 胞內酵素純化之SDS-PAGE(13.5%) 68
圖4.15 胞內純化酵素之Native PAGE(10%、13.5%) 69
圖4.16 胞內α-半乳糖水解酵素之血型轉換 70
圖4.17 分泌蛋白(胞外)經分子篩(S-200)液相層析管柱 71
圖4.18 乳酸菌分泌蛋白質之SDS-PAGE(13.5%) 73
圖4.19 乳酸菌分泌蛋白質之Native PAGE(10%) 74
圖4.20 乳酸菌分泌酵素作血型轉換 76
參考文獻 1. P.M,Dey,J.B.Pridham, Adv.Enzymol 36 (1972) 91.
2. Dey, P.M, Campillo, E.D,Biochemistry of the multiple forms
of glycosidases in plants. Adv. Enzymol. Relat.Areas Mol. Biol.
1984,56,141-249.
3. French D,Advan. Carbohyd Chem,9,149(1954).
4. Watkins,W.M,in A.Gottschalk(editor), Glycoproteins,their
composition, structure and function, American Elsevier, New York,
1966,462.
5. Muir.L,Y-C Lee , J.Biol Chem,244,2343(1969).
6. Garman S.C , Garboczi D.N , The molecular defect leading to Fabry
disease: structure of human alpha-galactosidase.
J.Mol.Biol.337:319-335(2004).
7. Bishop D.F., Kornreich R., Desnick R.J. , Structure organization of
the human alpha-galactosidase A gene: further evidence for the
absence of a 3’untranslated region ; Proc. Nati.Acad.Sci. USA.
85:3903-3907(1988).
8. Bishop D.F., Calhoun D.H., Bernstein H.S.,Hantzopoulos P.,
Human alpha-galactosidase A: nucleotide sequence of a cDNA Clone
encoding the mature enzyme , Proc. Nati.Acad.Sci. USA.
83:4859-4863(1986).
9. I.Polikarpov,A.M.Golubev,A.A.Kulminskaya,K.N.Neustroev,..etc,
Crystal structure ofα-Galactosidase from Trichoderma reesei and its
complex with galactose: Implications for catalytic mechanism ,
J.Mol.Biol. (2004)339,413-422 .
10. Hideyuki Kobaya,Wook-Dong Kim,α-Galactosidase from cultured
rice(Oryza sativa L. var. Nipponbare)cells, Phytochemistry 61 (2002)
621-630.
11. Fujimoto Z.,Kaneko S.,Momma M.,Kobayashi H.,Mizuno H.,
Crystal structure of rice alpha-galactosidase complexed With
D-galactose , J.Biol.Chem.278:20313-20318(2003).
12. Hideo Suzuki,Su-Chen Li,Yu-Ten Li,α-Galactosidase from Mortierella
vinacea. Crystalliztion and properties. J.Biol.Chem. 245(1970)781-786.
13. Y-T Li ,J.Biol.Chem.,241,1010(1966).
14. Charles Masson,Idrissa Cisse’,Virginie Simon,Paolo Insalaco,
Maurice Audran , Fbry disease: a review, Joint Bone Spine71(2004)
381-383.
15. Jack Goldstein,Alex Zhu,Rosa Hurst, High-level expression and
purification of coffee bean α-Galactosidase produced in the Yeast
Pichia pastoris. Archives of Biochemistry and Biophysics, vol.324 ,
65-70,1995.
16. Hubert Krotkiewski,Maria Podbielska, ABH blood group antigens in
O-glycans of human glycophorin A. Archives of Biochemistry and
Biophysics 429(2004)145-153.
17. Martin L. Olsson,Cheryl A, Universal red blood cell-enzymatic
conversion of blood group A and B antigens.
Transfusion Clinique et BiologiqueII(2004) 33-39.
18. Su-Fan Chien, Marie Lin , The conversion of group B red blood cells
into group O by an α-D-Galactosidase from taro(Colocasia esculenta)
, Carbohydrate Research ,217(1991) 191-200.
19. L Hobbs,M Mitra,R Phillips, H Haibach,D Smith , Deantigenation of
human type B erythrocytes with Clycine max α-Galactosidase ,
Biomed and Pharmacother(1995) 5,244-250.
20. Jack Goldstein,Alex Zhu, Characterization of recombinant
α-Galactosidase for use in seroconversion from blood group B to O
of human erythrocytes , Archives of Biochemistry and Biophysics ,
volumn327,N02, March15,324-329,1996.
21. Majeed M,Prakash , L.Lactospore: The Effective Probiotic.
Piscataway,NJ:NutrScience Publishers,Inc.;1998.
22. Jian-Qiang Fan,Satoshi Ishii,Hidekatsu Yoshioka, Transgenic
mouse expressing human mutantα-Galactosidase A in an endogenous
enzyme deficient background: a biochemical animal model for studying
active-site specific chaperone therapy for Fabry disease ,
Biochimica et Biophysica Acta1690 (2004) 250-257.
23. Kenneth Lowe , Blood substitutes , Education in Chemistry,July 2004,
95-97.
24. K.C.Lowe and E. Ferguson , J.Int.Med., 2003,253,498.
25. J.C.Fratantoni in Blood cell substitutes, A.S.Rudolph,R. Rabinovici
and G.Z.Feuerstein(eds),p29. New York: Marcel Dekker, 1998.
論文使用權限
  • 不同意紙本論文無償授權給館內讀者為學術之目的重製使用。
  • 不同意授權瀏覽/列印電子全文服務。


  • 若您有任何疑問,請與我們聯絡!
    圖書館: 請來電 (02)2621-5656 轉 2281 或 來信