淡江大學覺生紀念圖書館 (TKU Library)
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系統識別號 U0002-2506200710194800
中文論文名稱 功能性環化胍基衍生物的合成與其在質譜訊號強化之應用
英文論文名稱 Synthesis of Functional Cyclic Guanidino Derivatives and Their Application in the Signal Enhancement of Mass Spectrometer
校院名稱 淡江大學
系所名稱(中) 化學學系碩士班
系所名稱(英) Department of Chemistry
學年度 95
學期 2
出版年 96
研究生中文姓名 謝裕澤
研究生英文姓名 Yu-Tse Shieh
學號 694170308
學位類別 碩士
語文別 中文
口試日期 2007-06-01
論文頁數 104頁
口試委員 指導教授-鄭建中
指導教授-施增廉
委員-徐秀福
中文關鍵字 微量蛋白質  基質輔助雷射脫附游離法  訊號強化  胍基衍生物  正電荷 
英文關鍵字 Low Abundant Proteins  MALDI  Signal Enhancement  Guanidino Derevitives  Positive Charge 
學科別分類 學科別自然科學化學
中文摘要 微量蛋白質的偵測,在蛋白質體學研究中是非常具挑戰的主題。利用化學法修飾生物分子的帶電性,進而提升質譜訊號的靈敏度,則是目前具有潛力的解決方法之ㄧ。其中以胍基衍生物來修飾的胜肽,則是最值得注意的。然而其化學修飾物之官能基與訊號強度之間的關係並未探討。本論文將利用開發出新的環化合成方法,來製備出具推電子基、五環、六環、氫氧基及掌性異構之不同功能性之試劑,再與胜肽中離胺酸耦合成一系列的胍基衍生物,經由NMR 鑑定,高效能液相層析儀分析,及LC-MS/MS 確認這些胍基衍生物的形成。利用基質輔助雷射脫附游離質譜,將胰蛋白酶水解之肌紅蛋白中的ㄧ段胜肽與化學試劑耦合之結構與訊號強度之間的探討。經比對結果顯示,六環結構於質譜訊號強化15.1 倍、五環強化9.2 倍、推電子基強化12.3 倍、氫氧基強化7.6 倍與掌性異構強化12.3-12.4 倍。此結果顯示出,電荷的穩定性對訊號靈敏度的提升,具有決定性的影響,對後續研發ICAT 與iTRAQ 等蛋白質定量試劑具有相當重要的指標意義。
英文摘要 Detection of low abundant proteins is one of challenging topics in proteomics. Guanidino group was demonstrated to enhance the signal instensity in MALDI experiments. This report described a novel synthetic pathway to prepare the cyclic guanidino derivatives. The guanidino moiety was generated by O-ethylisourea and amino group of lysine-specific side chain. The characterization and identification was performed by NMR, HPLC, LC-MS/MS and MALDI. The result suggested the stabilization of positive charge at guanidino group plays an important role in signal enhancement of mass spectra of proteins. These results provide a further application in the ICAT and iTRAQ for
protein quantification.
論文目次 目錄
中文摘要...................................................I
英文摘要..................................................II
目錄.....................................................III
圖目錄....................................................VI
表目錄...................................................VII
附圖目錄................................................VIII

第一章 緒論
1-1 前言...................................................1
1-2 質譜應用在蛋白質身份鑑定介紹...........................2
1-2-1 胜肽指紋鑑定.........................................3
1-2-2 串聯式質譜法鑑定蛋白質身份...........................4
1-3 化學法修飾應用在質譜訊號強化...........................6
1-3-1 化學修飾胜肽標記的介紹...............................7
1-4 功能性環化胍衍生物的合成背景...........................9

第二章 實驗步驟
2-1 材料與方法............................................13
2-2 訊號試劑環化合成步驟與產率計算........................19
2-3 胜肽合成的步驟........................................24
2-4 胍基合成反應實驗步驟..................................28
2-5 高效能液相層析分離純化方法............................30
第三章 結果與討論
3-1 原理介紹..............................................32
3-1-1 固相胜肽合成法......................................32
3-1-2 基質輔助雷射脫附游離原理............................43
3-1-3 微波促進反應合成方法................................43
3-1-4 高效能液相層析法....................................46
3-2 設計合成概念..........................................47
3-2-1 化學修飾合成設計....................................47
3-2-2 胜肽序列合成設計....................................48
3-2-3 合成通式............................................49
3-3 訊號試劑合成反應......................................50
3-4 胜肽序列合成反應......................................52
3-5 胍基合成反應討論......................................53
3-6 胜肽修飾與定量之討論..................................56
3-7 訊號試劑的分離與純化..................................56
3-8 不同訊號輔助試劑之間的訊號差異結果....................57
3-9 未來設計衍生概念與應用................................59
3-10 結論.................................................60
參考文獻..................................................62
光譜附錄..................................................65

圖目錄
圖1、蛋白質體學的研究流程圖................................2
圖2、胜肽片段之序列斷裂流程示意圖..........................4
圖3、離子碎片的命名法......................................5
圖4、訊號試劑於質譜應用前後差異............................6
圖5、胜肽化學修飾位置之pKa 標示圖..........................7
圖6、胍基的pKa 值與MALDI 質譜儀訊號間的關係...............10
圖7、胍基與串聯式質譜儀訊號間的關係.......................11
圖8、多步合成2-甲烷氧- 4,5-二氫-1H-咪唑反應流程...........12
圖9、DCC 耦合反應機構.....................................37
圖10、茚三酮的反應機制....................................39
圖11、固相胜肽合成圖......................................40
圖12、Fmoc 樹脂切除試劑選擇流程圖.........................41
圖13、固相胜肽合成實驗流程圖..............................42
圖14、基質輔助雷射脫附游離質譜示意圖......................43
圖15、微波頻率的界定......................................44
圖16、傳統傳導加熱與微波加熱示意圖........................45
圖17、合成設計概念........................................47
圖18、合成設計通式........................................49

表目錄
表1、胜肽胺基化學修飾優缺點比較............................9
表2、HPLC 之梯度沖提溶劑與滯留時間條件分配................30
表3、樹脂顆粒大小.........................................34
表4、不同訊號試劑合環反應產率表...........................50
表5、胺基酸合成胜肽序列反應產率表.........................52
表6、訊號試劑與序列GAKWG 耦合反應產率.....................55
表7、訊號試劑應用質譜計算訊號相對強度差異.................58

附圖目錄
附圖1、化合物1 之1H NMR (300 MHz, CDCl3)..................65
附圖2、化合物1 之13C NMR (75.4 MHz, CDCl3)................66
附圖3、化合物1 之ESI-TOF MS 圖譜..........................67
附圖4、化合物2 之1H NMR (300 MHz, D2O)....................68
附圖5、化合物2 之ESI-TOF MS 圖譜..........................69
附圖6、化合物3 之1H NMR (300 MHz, CDCl3)..................70
附圖7、化合物3 之13C NMR (75.4 MHz, CDCl3)................71
附圖8、化合物3 之ESI-TOF MS 圖譜..........................72
附圖9、化合物4 之1H NMR (300 MHz, D2O)....................73
附圖10、化合物4 之13C NMR (75.4 MHz, D2O).................74
附圖11、化合物4 之ESI-TOF MS 圖譜.........................75
附圖12、化合物5 之1H NMR (300 MHz, CDCl3).................76
附圖13、化合物5 之13C NMR (75.4 MHz, CDCl3)...............77
附圖14、化合物5 之ESI-TOF MS 圖譜.........................78
附圖15、化合物6 之1H NMR (300 MHz, CDCl3).................79
附圖16、化合物6 之ESI-TOF MS 圖譜.........................80
附圖17、化合物7 之1H NMR (300 MHz, D2O)...................81
附圖18、化合物7 之13C NMR (75.4 MHz, D2O).................82
附圖19、化合物7 之ESI-TOF MS 圖譜.........................83
附圖20、化合物8 之1H NMR (300 MHz, D2O)...................84
附圖21、化合物8 之13C NMR (75.4 MHz, D2O).................85
附圖22、化合物8 之ESI-TOF MS 圖譜.........................86
附圖23、化合物9 之1H NMR (300 MHz, D2O)...................87
附圖24、化合物10 之1H NMR (300 MHz, D2O)..................88
附圖25、化合物10 之MALDI-TOF MS 譜圖......................89
附圖26、化合物9 與化合物1 耦合加熱反應之NMR 分析圖........90
附圖27、化合物9 與化合物1 耦合加熱50 ℃反應19 小時之ESI-MS
譜圖......................................................91
附圖28、化合物10 與化合物1 耦合微波加熱溫度測試反應之NMR
分析圖....................................................92
附圖29、化合物10 與化合物1 耦合微波加熱時間測試反應之NMR
分析圖....................................................93
附圖30、化合物10 與化合物1 耦合微波加熱80 ℃反應50 分鐘
之ESI-MS 譜圖.............................................94
附圖31、化合物1 與化合物9 耦合反應之LC-MS/MS 圖譜.........95
附圖32、化合物2 與化合物9 耦合反應之LC-MS/MS 圖譜.........96
附圖33、化合物3 與化合物9 耦合反應之LC-MS/MS 圖譜.........97
附圖34、化合物4 與化合物9 耦合反應之LC-MS/MS 圖譜.........98
附圖35、化合物6 與化合物9 耦合反應之LC-MS/MS 圖譜.........99
附圖36、化合物7 與化合物9 耦合反應之LC-MS/MS 圖譜........100
附圖37、不同訊號試劑之高效能液相層析分離圖譜.............102
附圖38、化合物9 之高效能液相層析分離.....................102
附圖39、化合物11 之MALDI-TOF/TOF 譜圖....................103
附圖40、化合物1、5 分別與化合物11 耦合測MALDI-TOF/TOF譜圖..104
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