微量蛋白質的偵測，在蛋白質體學研究中是非常具挑戰的主題。利用化學法修飾生物分子的帶電性，進而提升質譜訊號的靈敏度，則是目前具有潛力的解決方法之ㄧ。其中以胍基衍生物來修飾的胜肽，則是最值得注意的。然而其化學修飾物之官能基與訊號強度之間的關係並未探討。本論文將利用開發出新的環化合成方法，來製備出具推電子基、五環、六環、氫氧基及掌性異構之不同功能性之試劑，再與胜肽中離胺酸耦合成一系列的胍基衍生物，經由NMR 鑑定，高效能液相層析儀分析，及LC-MS/MS 確認這些胍基衍生物的形成。利用基質輔助雷射脫附游離質譜，將胰蛋白酶水解之肌紅蛋白中的ㄧ段胜肽與化學試劑耦合之結構與訊號強度之間的探討。經比對結果顯示，六環結構於質譜訊號強化15.1 倍、五環強化9.2 倍、推電子基強化12.3 倍、氫氧基強化7.6 倍與掌性異構強化12.3-12.4 倍。此結果顯示出，電荷的穩定性對訊號靈敏度的提升，具有決定性的影響，對後續研發ICAT 與iTRAQ 等蛋白質定量試劑具有相當重要的指標意義。

Detection of low abundant proteins is one of challenging topics in proteomics. Guanidino group was demonstrated to enhance the signal instensity in MALDI experiments. This report described a novel synthetic pathway to prepare the cyclic guanidino derivatives. The guanidino moiety was generated by O-ethylisourea and amino group of lysine-specific side chain. The characterization and identification was performed by NMR, HPLC, LC-MS/MS and MALDI. The result suggested the stabilization of positive charge at guanidino group plays an important role in signal enhancement of mass spectra of proteins. These results provide a further application in the ICAT and iTRAQ for
protein quantification.

目錄
中文摘要...................................................I
英文摘要..................................................II
目錄.....................................................III
圖目錄....................................................VI
表目錄...................................................VII
附圖目錄................................................VIII

第一章 緒論
1-1 前言...................................................1
1-2 質譜應用在蛋白質身份鑑定介紹...........................2
1-2-1 胜肽指紋鑑定.........................................3
1-2-2 串聯式質譜法鑑定蛋白質身份...........................4
1-3 化學法修飾應用在質譜訊號強化...........................6
1-3-1 化學修飾胜肽標記的介紹...............................7
1-4 功能性環化胍衍生物的合成背景...........................9

第二章 實驗步驟
2-1 材料與方法............................................13
2-2 訊號試劑環化合成步驟與產率計算........................19
2-3 胜肽合成的步驟........................................24
2-4 胍基合成反應實驗步驟..................................28
2-5 高效能液相層析分離純化方法............................30
第三章 結果與討論
3-1 原理介紹..............................................32
3-1-1 固相胜肽合成法......................................32
3-1-2 基質輔助雷射脫附游離原理............................43
3-1-3 微波促進反應合成方法................................43
3-1-4 高效能液相層析法....................................46
3-2 設計合成概念..........................................47
3-2-1 化學修飾合成設計....................................47
3-2-2 胜肽序列合成設計....................................48
3-2-3 合成通式............................................49
3-3 訊號試劑合成反應......................................50
3-4 胜肽序列合成反應......................................52
3-5 胍基合成反應討論......................................53
3-6 胜肽修飾與定量之討論..................................56
3-7 訊號試劑的分離與純化..................................56
3-8 不同訊號輔助試劑之間的訊號差異結果....................57
3-9 未來設計衍生概念與應用................................59
3-10 結論.................................................60
參考文獻..................................................62
光譜附錄..................................................65

圖目錄
圖1、蛋白質體學的研究流程圖................................2
圖2、胜肽片段之序列斷裂流程示意圖..........................4
圖3、離子碎片的命名法......................................5
圖4、訊號試劑於質譜應用前後差異............................6
圖5、胜肽化學修飾位置之pKa 標示圖..........................7
圖6、胍基的pKa 值與MALDI 質譜儀訊號間的關係...............10
圖7、胍基與串聯式質譜儀訊號間的關係.......................11
圖8、多步合成2-甲烷氧- 4,5-二氫-1H-咪唑反應流程...........12
圖9、DCC 耦合反應機構.....................................37
圖10、茚三酮的反應機制....................................39
圖11、固相胜肽合成圖......................................40
圖12、Fmoc 樹脂切除試劑選擇流程圖.........................41
圖13、固相胜肽合成實驗流程圖..............................42
圖14、基質輔助雷射脫附游離質譜示意圖......................43
圖15、微波頻率的界定......................................44
圖16、傳統傳導加熱與微波加熱示意圖........................45
圖17、合成設計概念........................................47
圖18、合成設計通式........................................49

表目錄
表1、胜肽胺基化學修飾優缺點比較............................9
表2、HPLC 之梯度沖提溶劑與滯留時間條件分配................30
表3、樹脂顆粒大小.........................................34
表4、不同訊號試劑合環反應產率表...........................50
表5、胺基酸合成胜肽序列反應產率表.........................52
表6、訊號試劑與序列GAKWG 耦合反應產率.....................55
表7、訊號試劑應用質譜計算訊號相對強度差異.................58

附圖目錄
附圖1、化合物1 之1H NMR (300 MHz, CDCl3)..................65
附圖2、化合物1 之13C NMR (75.4 MHz, CDCl3)................66
附圖3、化合物1 之ESI-TOF MS 圖譜..........................67
附圖4、化合物2 之1H NMR (300 MHz, D2O)....................68
附圖5、化合物2 之ESI-TOF MS 圖譜..........................69
附圖6、化合物3 之1H NMR (300 MHz, CDCl3)..................70
附圖7、化合物3 之13C NMR (75.4 MHz, CDCl3)................71
附圖8、化合物3 之ESI-TOF MS 圖譜..........................72
附圖9、化合物4 之1H NMR (300 MHz, D2O)....................73
附圖10、化合物4 之13C NMR (75.4 MHz, D2O).................74
附圖11、化合物4 之ESI-TOF MS 圖譜.........................75
附圖12、化合物5 之1H NMR (300 MHz, CDCl3).................76
附圖13、化合物5 之13C NMR (75.4 MHz, CDCl3)...............77
附圖14、化合物5 之ESI-TOF MS 圖譜.........................78
附圖15、化合物6 之1H NMR (300 MHz, CDCl3).................79
附圖16、化合物6 之ESI-TOF MS 圖譜.........................80
附圖17、化合物7 之1H NMR (300 MHz, D2O)...................81
附圖18、化合物7 之13C NMR (75.4 MHz, D2O).................82
附圖19、化合物7 之ESI-TOF MS 圖譜.........................83
附圖20、化合物8 之1H NMR (300 MHz, D2O)...................84
附圖21、化合物8 之13C NMR (75.4 MHz, D2O).................85
附圖22、化合物8 之ESI-TOF MS 圖譜.........................86
附圖23、化合物9 之1H NMR (300 MHz, D2O)...................87
附圖24、化合物10 之1H NMR (300 MHz, D2O)..................88
附圖25、化合物10 之MALDI-TOF MS 譜圖......................89
附圖26、化合物9 與化合物1 耦合加熱反應之NMR 分析圖........90
附圖27、化合物9 與化合物1 耦合加熱50 ℃反應19 小時之ESI-MS
譜圖......................................................91
附圖28、化合物10 與化合物1 耦合微波加熱溫度測試反應之NMR
分析圖....................................................92
附圖29、化合物10 與化合物1 耦合微波加熱時間測試反應之NMR
分析圖....................................................93
附圖30、化合物10 與化合物1 耦合微波加熱80 ℃反應50 分鐘
之ESI-MS 譜圖.............................................94
附圖31、化合物1 與化合物9 耦合反應之LC-MS/MS 圖譜.........95
附圖32、化合物2 與化合物9 耦合反應之LC-MS/MS 圖譜.........96
附圖33、化合物3 與化合物9 耦合反應之LC-MS/MS 圖譜.........97
附圖34、化合物4 與化合物9 耦合反應之LC-MS/MS 圖譜.........98
附圖35、化合物6 與化合物9 耦合反應之LC-MS/MS 圖譜.........99
附圖36、化合物7 與化合物9 耦合反應之LC-MS/MS 圖譜........100
附圖37、不同訊號試劑之高效能液相層析分離圖譜.............102
附圖38、化合物9 之高效能液相層析分離.....................102
附圖39、化合物11 之MALDI-TOF/TOF 譜圖....................103
附圖40、化合物1、5 分別與化合物11 耦合測MALDI-TOF/TOF譜圖..104

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