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系統識別號 U0002-2307200813471000
中文論文名稱 Serratia sp. TKU019所生產蛋白酶及幾丁聚醣酶之純化與定性
英文論文名稱 Purification and Characterization of Protease and Chitosanase from Serratia sp.TKU019
校院名稱 淡江大學
系所名稱(中) 生命科學研究所碩士班
系所名稱(英) Graduate Institute of Life Sciences
學年度 96
學期 2
出版年 97
研究生中文姓名 郭懿萱
研究生英文姓名 Yi-Hsuan Kuo
學號 695180116
學位類別 碩士
語文別 中文
口試日期 2008-07-17
論文頁數 86頁
口試委員 指導教授-王三郎
委員-陳銘凱
委員-陳佑汲
中文關鍵字 幾丁質酶  幾丁聚醣酶  蛋白酶 
英文關鍵字 chitinase  chitosanase  protease 
學科別分類 學科別醫學與生命科學生物學
中文摘要 TKU019 係以蝦殼粉為唯一碳/氮源,篩選自台灣北部土壤之一株幾丁質酶、幾丁聚醣酶及蛋白酶生產菌,經鑑定為Serratia sp.。TKU019生產幾丁質酶、幾丁聚醣酶及蛋白酶之較適培養條件為含有0.5% 蝦殼粉、0.1 % K2HPO4及0.05 % MgSO4.7H2O之液態培養基 (pH 7)在37℃搖瓶培養3天。所得發酵上清液,經硫酸銨沉澱、DEAE-Sepharose、Macro- prep DEAE Cartridge及Sephacryl S-100等層析步驟,純化出一種幾丁質酶、幾丁聚醣酶 (C1),及一種蛋白酶 (P1) ,經SDS-PAGE測其分子量分別為36 kDa及58 kDa。
於最適反應pH、最適反應溫度、pH安定、熱安定性方面,幾丁質酶為pH 11、60℃、pH 7-10及<40℃;幾丁聚醣酶為pH 7、60℃、pH 4-7及<40℃。蛋白酶之最適反應pH、最適反應溫度、pH安定、熱安定性則分別為pH10、50℃、pH 5-9及<40℃。C1及P1之活性會受Mn2+、EDTA 所抑制,而 2% (v/v) Tween 40可使P1活性提升 175%。
探討以烏賊軟骨粉 (SPP)及蝦殼粉 (SSP)作為碳源時,其上清液還原醣量的差異。發現以1.5% SPP及 1% SSP 作為碳源時、發酵第五天及第三天,上清液所含還原醣量最高,分別為 900μg/ml 及 270μg/ml。
以SPP及SSP作為碳源時,分析培養上清液的抗氧化活性。結果發現,0.5%及1% 的SPP及SSP,發酵第一天到第四天,皆具DPPH清除效果。
英文摘要 The protease and chitosanase producing strain, Serratia sp. TKU019, was isolated from the soil in Taiwan. The optimized condition for protease and chitosanase production were found when the culture was shaken at 37℃ for 3 days in 100mL of medium contain 0.5% shrimp shell powder (SSP), 0.1 % K2HPO4 and 0.05 % MgSO4.7H2O (pH7).
One chitosanase (C1) and one protease (P1) were purified by chromatography procedures of DEAE-Sepharose, Macro-prep DEAE Cartridge, and Sephacryl S-100. The molecular mass of the chitosanase (C1) and the protease (P1) determined by SDS-PAGE was approximately 36 kDa and 57 kDa, respectively.
The optimum pH, optimum temperature, pH stability, and thermal stability of C1 were ( pH 11, 60℃, pH 7-10 and <40℃),(using colloidal chitin as substrate) and ( pH7, 60℃, pH 4-7 and <40℃) ,(using chitosan as substrate).Those of P1 were pH 10, 50℃, pH 5-9 and <40℃,respectively. Both of C1 and P1 were inactivated by Mn2+ and EDTA, but only P1 activated by 2% (v/v) Tween 40.
The result of the effects of SPP and SSP on reducing sugars show that, the culture supernatant of SPP (1.5%, 5th day) and SSP (1%, 3rd day) had the highest concentration of reducing sugars ( 900 μg/ml and 270 μg/ml, respectively).
To analyze antioxidant activity, it was found the culture supernatant of SPP (0.5%, 2 nd day) and SSP (1.5%, 1st day) had the best results of the DPPH free radical scavenging activity.
論文目次 目錄



頁次

中文摘要 ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• I
英文摘要 ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• Ш
目錄 ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• VI
圖目錄 ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• X
表目錄 ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• XII

第一章 緒論•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 1
第二章 文獻回顧•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 2
2.1 幾丁質及幾丁聚醣•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 2
2.2 幾丁質與幾丁聚醣水解酵素••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 3
2.2.1 幾丁質酶•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 3
2.2.2 幾丁聚醣酶•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 3
2.3 蛋白酶水解酵素••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 4
2.3.1 蛋白酶之簡介•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 4
2.3.2 蛋白酶之分類••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 4
2.3.3 蛋白酶之應用••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 4
2.4 N-乙醯幾丁寡醣及幾丁寡醣•••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 5
2.4.1 N-乙醯幾丁寡醣及幾丁寡醣之簡介•••••••••••••••••••••••• 5
2.4.2 幾丁質、幾丁聚醣及幾丁寡醣類之機能與利用••••••• 6
第三章 材料與方法•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 8
3.1 實驗菌株•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 8
3.2 實驗材料 •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 8
3.3 實驗儀器•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 9
3.4 生產菌株之篩選•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 9
3.5 蛋白酶之活性測定•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 10
3.6 幾丁質酶之活性測定••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 10
3.7 幾丁聚醣酶之活性測定•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 11
3.8 蛋白酶之較適培養條件探討••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 11
3.8.1 碳/氮源之選擇••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 11
3.8.2 培養基之酸鹼值•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 11
3.8.3 培養溫度••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 11
3.8.4 培養體積••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 12
3.8.5 較適培養時間•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 12
3.9 酵素之純化分離•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 12
3.9.1 粗酵素液之製備•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 12
3.9.2 離子交換樹脂層析法•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 13
3.9.3 膠體過濾層析•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 14
3.9.4 蛋白質電泳分析(Electrophoresis)••••••••••••••••••••••••••• 14
3.9.5 蛋白酶活性電泳••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 14
3.10 酵素生化特性分析•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 15
3.10.1 酵素最適反應溫度•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 15
3.10.2 酵素熱安定性••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 15
3.10.3 最適反應 pH••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 15
3.10.4 酵素 pH安定性••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 15
3.10.5 金屬離子與抑制劑對酵素活性之影響••••••••••••••••••• 16
3.10.6 介面活性劑對酵素活性之影響•••••••••••••••••••••••••••••••• 16
3.10.7 蛋白酶之基質特異性••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 16
3.10.8 幾丁質酶及幾丁聚醣酶之基質特異性•••••••••••••••••••• 17
3.11 蛋白質轉印•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 17
3.12 DPPH自由基清除能力之測定•••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 19
3.13 還原醣之測定•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 19
3.14 薄層色層分析•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 19
第四章 結果與討論•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 21
4.1 蛋白酶與幾丁聚醣酶/幾丁質酶生產菌之篩選•••••••••••• 21
4.2 菌株特性•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 21
4.3 碳/氮源之選擇••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 25
4.4 蛋白酶及幾丁聚醣酶/幾丁質酶較適生長條件探討•••• 25
4.5 蛋白酶及幾丁聚醣酶之純化分離••••••••••••••••••••••••••••••••• 26
4.5.1 粗酵素液製備••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 26
4.5.2 陰離子交換層析法••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 26
4.5.3 陰離子交換層析法••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 27
4.5.4 膠體過濾層析法•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 27
4.5.5 綜合結果•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 28
4.6 蛋白酶及幾丁聚醣酶之分子量判定••••••••••••••••••••••••••••• 28
4.6.1 蛋白酶-SDS-PAGE(CBR 染色法) ••••••••••••••••••••••••••••• 28
4.6.2 蛋白酶活性染色•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 28
4.6.3 綜合結果•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 28
4.7 蛋白酶與幾丁聚醣酶之生化特性分析•••••••••••••••••••••••••• 29
4.7.1 幾丁聚醣酶/幾丁質酶之最適反應溫度及熱安定性••• 29
4.7.2 蛋白酶之最適反應溫度及熱安定性••••••••••••••••••••••••••• 29
4.7.3 幾丁聚醣酶/幾丁質酶之最適 pH及 pH安定性•••••••••••• 29
4.7.4 幾丁聚醣酶/幾丁質酶之最適 pH及 pH安定性•••••••••••• 29

4.7.5 各種介面活性劑對蛋白酶及幾丁聚醣酶/幾丁質酶之影響•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••
30

4.7.6 金屬離子及抑制劑對蛋白酶與幾丁聚醣酶/幾丁質酶之影響•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••
30
4.7.7 蛋白酶之基質特異性•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 30
4.7.8 幾丁聚醣酶/幾丁質酶之基質特異性•••••••••••••••••••••••••• 31
4.7.9 蛋白酶勝肽質譜鑑定•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 31
4.8 TKU019上清液寡醣量討論•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 31

4.8.1 探討不同濃度蝦殼粉及烏賊軟骨粉培養TKU019所
得上清液寡醣量之差異•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••
32
4.8.2 TKU019上清液所含寡醣之組成探討•••••••••••••••••••••••••• 32
4.9 TKU019上清液寡醣量討論••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 33
4.9.1 TKU019發酵上清液之DPPH自由基清除能力探討••• 33

4.9.2 利用TLC法探討上清液中DPPH自由基清除能力之組成物質•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••
33
第五章 結論•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 78
參考文獻 •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 79

圖目錄

圖 4.1 Serratia TKU019之顯微鏡照片 ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 22
圖 4.2 16S rDNA 部份核酸序列分析•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 23
圖 4.3 API鑑定系統分析結果 ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 24
圖 4.4 蝦殼粉添加濃度對TKU019生產幾丁質酶活性之影響••••••••••••••••••• 34
圖 4.5 蝦殼粉添加濃度對TKU019生產幾丁聚醣酶活性之影響••••••••••••••• 35
圖 4.6 蝦殼粉添加濃度對TKU019生產蛋白酶活性之影響••••••••••••••••••••••• 36
圖 4.7 不同碳源對於TKU019生產幾丁質酶活性之影響•••••••••••••••••••••••••••• 37
圖 4.8 不同碳源對於TKU019生產蛋白酶活性之影響•••••••••••••••••••••••••••••••• 38
圖4.9 培養體積對TKU019生產幾丁質酶活性之影響••••••••••••••••••••••••••••••• 39
圖 4.10 培養體積對TKU019生產幾丁聚醣酶活性之影響••••••••••••••••••••••••• 40
圖 4.11 培養體積對TKU019生產蛋白酶活性之影響••••••••••••••••••••••••••••••••• 41
圖 4.12 培養基 pH值及溫度對TKU019生產幾丁質酶活性之影響•••••••••• 42
圖4.13 培養基 pH值及溫度對TKU019生產幾丁聚醣酶活性之影
響••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 43
圖 4.14 培養基 pH值及溫度對TKU019生產蛋白酶活性之影響•••••••••••••• 44
圖 4.15 TKU019培養於蝦殼培養基所產蛋白酶及幾丁聚醣酶/幾丁質酶
之生長曲線圖•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 45
圖 4.16 TKU019 所生產酵素之純化分離流程圖••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 46
圖 4.17 TKUO19之 DEAE-Sapharose CL-6B 圖譜層析圖•••••••••••••••••••••••••••• 47
圖 4.18 蛋白酶之 Macro-Prep DEAE Cartridge 圖譜層析圖••••••••••••••••••••••• 48
圖 4.19 幾丁聚醣酶/幾丁質酶之 Sephacryl S-100 層析圖譜••••••••••••••••••••••• 49
圖 4.20 TKU019 蛋白酶於SDS-PAGE之分子量分析•••••••••••••••••••••••••••••••••• 53
圖 4.21 TKU019幾丁聚醣酶於SDS-PAGE之分子量分析•••••••••••••••••••••••••••• 54
圖 4.22 蛋白酶活性染色•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 55
圖 4.23 TKU019幾丁質酶之最適反應溫度及熱安定性••••••••••••••••••••••••••••••• 58
圖 4.24 TKU019幾丁聚醣酶之最適反應溫度及熱安定性••••••••••••••••••••••••••• 59
圖 4.25 TKU019蛋白酶之最適反應溫度及熱安定性••••••••••••••••••••••••••••••••••• 60
圖 4.26 TKU019幾丁質酶之最適 pH及 pH安定性••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 61
圖4.27 TKU011幾丁聚醣酶之最適 pH及 pH安定性••••••••••••••••••••••••••••••••••• 62
圖 4.28 TKU019 蛋白酶之最適 pH及 pH 安定性•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 63
圖4.29 蛋白酶之胜肽質譜鑑定結果••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 69
圖4.30 還原醣定量之標準曲線••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 70
圖4.31 不同烏賊軟骨粉及蝦殼粉濃度對於TKU019上清液之寡糖量之影響•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 71
圖4.32 以0.5%烏賊粉培養之TKU019薄層層析圖••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 72
圖4.33 以0.5% 蝦殼粉培養之TKU019薄層層析圖••••••••••••••••••••••••••••••••••• 73
圖4.34 以1% 蝦殼粉培養之TKU019薄層層析圖•••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 74
圖4.35 不同濃度烏賊軟骨粉及蝦殼粉培養之發酵上清液DPPH自由基清除能力••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 75
圖4.36 0.5%及1%蝦殼粉培養之發酵上清液其DPPH清除力之薄層層析 圖•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 76

圖4.37 0.5%烏賊軟骨粉培養之發酵上清液其DPPH清除力之薄層層析
圖•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 77

表目錄

表 3.1 TKU011 生產蛋白酶及幾丁聚醣酶之較適條件 ••••••••••••••••••••••••••••••• 12
表 3.2 蛋白質轉印所需溶液配方••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 17
表 4.1 TKU019 蛋白酶純化總表••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 50
表 4.2 TKU019 幾丁聚醣酶純化總表••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 51
表 4.3 TKU019 幾丁質酶純化總表••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 52
表 4.4 蛋白酶特性比較•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 56
表 4.5 幾丁聚醣酶/幾丁質酶之特性比較••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 57
表 4.6 各種界面活性劑對酵素活性之影響••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 64
表 4.7 各種金屬離子對酵素活性之影響•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 65
表 4.8 Serratia sp TKU019特性比較•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 66
表 4.9 蛋白酶之基質特異性••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 67
表 4.10 幾丁聚醣酶/幾丁質酶之基質特異性•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 68

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