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系統識別號 U0002-2307200810432600
中文論文名稱 啤酒酵母菌醛類去氫酶2和3之選殖,過度表現,純化及酵素活性分析
英文論文名稱 Cloning, overexpression, purification and catalytic analysis of aldehyde dehydrogenase 2 and 3 from Saccharomyces cerevisiae
校院名稱 淡江大學
系所名稱(中) 生命科學研究所碩士班
系所名稱(英) Graduate Institute of Life Sciences
學年度 96
學期 2
出版年 97
研究生中文姓名 毛清源
研究生英文姓名 Ching-Yuan Mao
學號 695180066
學位類別 碩士
語文別 中文
口試日期 2008-07-21
論文頁數 42頁
口試委員 指導教授-陳銘凱
委員-王三郎
委員-官宜靜
中文關鍵字 啤酒酵母菌  乙醛去氫酶2  乙醛去氫酶3 
英文關鍵字 acetaldehyde dehydrogenase  ALD2  ALD3 
學科別分類 學科別醫學與生命科學生物學
中文摘要 啤酒酵母菌醛類去氫酶2(YMR170C)和醛類去氫酶3(YMR169C)皆為ACDH ( acetaldehyde dehydrogenase )家族中的一員,並被認為用NADP+當作輔酶。最近的文獻也顯示ALD2和ALD3會使泛酸的生合成途徑中的3-aminopropanal 轉變成β-alanine。

首先使用PCR將基因片段大量複製, ALD2和ALD3的基因片段長度皆為1521個鹼基,再用TA-cloning將其接於pGEM-T Easy Vector上,成為pGEM-T-ALD2和pGEM-T-ALD3。

避免影響醛類去氫酶的蛋白質結構,所以必須在最不破壞其基因序列的狀況下表現,將表現載體pYES2和pGEM-T-ALD2利用限制酶SacI、EcoRI進行切割,再用T4 DNA ligase接合成為質體pYES2-ALD2和pYES2-ALD3。將質體pYES2-ALD2和pYES2-ALD3先送入酵母菌宿主(BJ2168 strain),以2%galactose 誘導讓其在酵母菌中表現,並在大量表現之後,但是測不到活性。於是利用SacI、XbaI將質體pYES2-ALD3作切割後,利用T4 DNA ligase接合成為pYeSL-ALD3並與pYES2-ALD2同時送入酵母菌宿主strain(BJ2168)使得兩蛋白質同時在同一個酵母菌作大量表現。同樣地,我們也建構pYeSL-ALD2並與pYES2-ALD3在同一個酵母菌作大量表現。接著我們測定共表現之產物活性,並以質譜測定是否為正確的共表現組成。
英文摘要 In Saccharomyces cerevisiae ALD2 (YMR170C) and ALD3 (YMR169C) are the members of ACDH ( acetaldehyde dehydrogenase ) family, and the gene products supposed to use NADP+ as coenzyme. Recent literature also shows that ALD2 and ALD3 genes are required for pantothenic acid biosynthesis via conversion of 3-aminopropanal to β-alanine in vivo.

In this research, we cloned the ALD2 and ALD3 gene by polymerase chain recitation (PCR). The size of both DNA fragments are 1,521bp. The ORFs of ALD2 and ALD3 gene were cloned into pGEM-T easy vector by TA-cloning to obtained pGEM-T-ALD2 and pGEM-T-ALD3 plasmids

In order to express protein in yeast, we constructed plasmid pYES2-ALD2 and pYES2-ALD3 using SacI、EcoRI restriction sites from pGEM-T-ALD2 and pGEM-T-ALD3. We made use of 2% galactose to induce Ald2p and Ald3p to over-express in the S. cerevisiae (BJ2168 strain). But no catalytic activity can be found in both Ald2p and Ald3p. So we constructed plasmid pYeSL-ALD3 by SacI、XbaI restriction enzymes from pYES2-ALD3. We used 2% galactose to induce Ald2p (pYES2-ALD2) and Ald3p (pYeSL-ALD3) to co-over-express in BJ2168. Similarly, we constructed plasmid pYeSL-ALD2 and co-over-express with Ald3p (pYES2-ALD3). We then tested the activity of the co-over-expressed product and deterimined the components by mass spectrometry.
論文目次 目 錄
中文摘要………………………………………………………………………………………...I
英文摘要………………………………………………………………………………………..II
目錄………………………………………………………………………………………..............III
圖、表目錄……………………………………………………………………………………V
第一章 序論………………………………………………………….………………...……1
第二章 ALD2與ALD3之基因選殖及重組基因之次選殖…3
第一節 聚合酶鏈反應(PCR)複製處理……………………………………………3
2.1.1菌種來源(Template DNA為Yeast BJ2168 genomic DNA)……………………3
2.1.2聚合酶鏈反應(PCR)複製ALD2和ALD3基因…………………………………3
2.1.3 PCR產物的純化及確認………………………………………………………………...4
2.1.4 PCR產物之3’末端補“A”核苷酸…………………………………………………….5
第二節 ALD2與ALD3之基因選殖(TA-cloning)……………………………6
2.2.1 DNA的接合反應(DNA ligation)……………………………………………………6
2.2.2大腸桿菌之質體轉型 (E.coli transformation -DH5a) …………………………...7
2.2.3 藍白篩選…………………………………………………………………………………...8
2.2.4質體DNA的抽取(大腸桿菌)…………………………………………………………8
2.2.5使用限制酶做質體的確認……………………………………………………………...9
2.2.6 DNA定序分析………………………………………………………………….…………9
第三節 結果與討論……………………………………………………………………...…10
第三章 ALD2和ALD3的蛋白質的表現………………………...……….12

第一節 pYES2-ALD2 質體建構與 Ald2p 重組蛋白表現與
pYES2-ALD3 質體建構與 Ald3p 重組蛋白表現……….……12
3.1.1大量複製表現載體pYES2…………………………………………………………12
3.1.2接合反應………………………………………………………………………………...12
3.1.3大腸桿菌之質體轉型(Transformation)………………………………………14
3.1.4抽取質體DNA並以限制酶做確認………………………………………………14
3.1.5 將pYES2-ALD2和pYES2-ALD3以酵母菌轉型作用送到
酵母菌菌株BJ2168之中…………………………………………………………..15
3.1.6 將送入酵母菌(BJ2168)中的plasmid做確認…………………………………..17
第二節 Ald2p和Ald3p的誘導表現以及純化……………………………..17
3.2.1 目標蛋白質ald2p和ald3p的表現………………………………………………17
3.2.2 超音波破碎細胞……………………………………………………………………...18
3.2.3 以SDS-PAGE 膠體電泳法分析粗抽蛋白質…………………………………18
3.2.4 親和性膠體(Blue)純化……………………………………………………………...20
3.2.5酵素活性之測定……………………………………………………………………….21
第三節 結果與討論……………………………………………………………………...21
第四章 ALD2和ALD3蛋白質的共表現…………………...……………27
第一節 pYES2-ALD2和pYES2-ALD3質體建構和共表現…………27
4.1.1純化出ALD2和ALD3基因……………………………………………………27
4.1.2製備pYeSL-ALD2和pYeSL-ALD3…………………………………………..28
4.1.3將pYeSL-ALD2和pYeSL-ALD3送入含有分別含有pYES2-ALD3和pYES2-ALD2的酵母菌BJ2168之中…………………………………………29
4.1.4 將L2S3(BJ2168)和L3S2(BJ2168)的誘導表現……………………………..29
4.1.5 將L2S3(BJ2168)和L3S2(BJ2168)作活性分析……………………………..30
4.1.6 使用Native-PAGE梯度電泳分析……………………………………………...30
4.1.7 以FPLC-Mono Q純化蛋白質…………………………………………………..31
第二節 結果與討論……………………………………………………………………...32
第五章 結論……………………………………………………………………………….…38
第六章 參考資料…………………………………………………………………………39
附錄一……………………………………………………………………………..41
附錄二……………………………………………………………………………..42

圖、表目錄
圖目錄
圖1-1:乙醛去氫酶和在丙酮酸去氫酶途徑中(PDH bypass)與acetate、acetyl-CoA等的相關代謝途徑圖…………………………………...…1
圖2-1:PCR產物………………………………………………………………10
圖2-2:補完A後以限制酶切割確認……………………………………….…11
圖2-3:基因接上TA-cloning以EcoRI作切割確認…………………………11
圖3-1:定序完TA-cloning以限制酶 SacI和EcoRI切下……….…………22
圖3-2:使用EcoRI和SacI切下6kb位置的pYES2載體..……….…………22
圖3-3:以HindIII 確認pYES2-ALD2和pYES2-ALD3………..……………23
圖3-4:以EcoRI和SacI 再次確認pYES2-ALD2和pYES2-ALD3…………23圖3-5:ALD2和ALD3不同時間未誘導和誘導比較圖12~24小時..………24
圖3-6:ALD2和ALD3不同時間未誘導和誘導比較圖36~48小時...………25
圖3-7:ALD2以親和性膠體Blue純化圖………….…………………………25
圖3-8:ALD3以親和性膠體Blue純化圖…………….………………………26
圖4-1:pGEM-T-ALD2和pGEM-T-ALD3與EcoRI和Sac I各反應一次……32
圖4-2:pYeSL-ALD2以限制酶Xba I和Sac I作切割確認………….…………33
圖4-3:pYeSL-ALD 3以限制酶Xba I和Sac I作切割確認………….…………33
圖4-4:L2S3不同時間未誘導和誘導比較圖12∼48小時………….…………34
圖4-5:L2S3不同時間未誘導和誘導比較圖60∼96小時………….…………34
圖4-6:L3S2不同時間未誘導和誘導比較圖12∼48小時………….…………35
圖4-7:L3S2不同時間未誘導和誘導比較圖60∼96小時……...…..…………35
圖4-8:L2S3以親和性膠體Blue SepharoseTM 6 Fast Flow純化結果…………36
圖4-9:L3S2以親和性膠體Blue SepharoseTM 6 Fast Flow純化結果…………36
圖 4-10:L3S2以親和性膠體Blue SepharoseTM 6 Fast Flow純化後再以
FPLC-MonoQ做二次純化的電泳分析結果………….……………37
圖 4-11:L3S2以親和性膠體Blue SepharoseTM 6 Fast Flow純化後以Native page電泳進行3.5小時分析之結果………….….…………………37
圖 4-12:L3S2以親和性膠體Blue SepharoseTM 6 Fast Flow純化後以Native page電泳進行5小時分析之結果………….………………………38
表目錄
表2-1:PCR反應組成成份…………………………………………....…………4
表2-2:補A反應試劑組成…………………………………..…….……………5
表2-3:DNA sample(ALD2)與限制酶切割反應組成…………….…………6
表2-4:DNA sample(ALD3)與限制酶切割反應組成…………….…………6
表2-5:接合反應試劑組成…………………………………..……………..……7
表2-6:以限制酶EcoRI進行確認……………………………..……………..…9
表3-1:使用限制酶EcoRI進行ALD2、ALD3和pYES2切割………………12
表3-2:使用限制酶SacI進行ALD2、ALD3和pYES2切割…………………13
表3-3:pYES2載體切除磷酸根反應………………………………..…………13
表3-4:ALD2、ALD3和pYES2載體的接合反應……………………………14
表3-5:限制酶HindIII對質體做確認…………………………………………14
表3-6:限制酶EcoRI和SacI對質體做確認………………………….………15
表3-7 酵母菌轉型作用Buffer 1………………………………………………..16
表3-8 酵母菌轉型作用Buffer 2 (PTLAD buffer)……………………………...16
表3-9:12.5%分離凝膠組成…………………………………..……………….19
表3-10:3.7%焦集凝膠組成………………………………...…………………19
表3-11:酵素活性之測定所用各成份組成……………………………….……21
表3-12:酵素活性之測定所用緩衝液成份………………………………….…21
表4-1:DNA sample (ALD2或ALD3)與限制酶切割反應組成………………..27
表4-2:DNA sample (ALD2或ALD3)與限制酶切割反應組成.…………...…..27
表4-3:接合反應試劑組成 ……………………………………………………..28
表4-4:pYeSL-ALD2和pYeSL-ALD3與限制酶XbaI切割反應組成 ……..28
表4-5:pYeSL-ALD2和pYeSL-ALD3與限制酶Sac I切割反應組成 ……..29
表4-6:Native-PAGE 梯度電泳 12.5% 膠集凝膠組成 …………………….31
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