Mastoparan B (MP-B) 是從黑腹胡蜂(Vespa basalis)的毒液中所分離出來的，是由14個胺基酸所組成的抗菌胜肽，其特色為含有多個正電性胺基酸殘基。在水中的構形相當不穩定，但在TFE(三氟乙醇)水溶液中能夠形成穩定的兩親性結構。在此，我們將抗菌胜肽C端進行胺化的修飾，並探討MP-B-NH2和MP-B-COO-及其衍生物9F-MP-B-NH2和9F-MP-B-COO-的結構、動力學行為與抗菌活性之間的關係。
    從CD實驗中發現，胜肽在水中為無序纏繞的狀態，在30 % TFE溶液中形成α螺旋結構。由於C端胺化的原因，使得末端殘基的二次化學位移有明顯的不同，我們推測是由於胺化後的胜肽能夠提供額外的H鍵，進而使得靠近末端的殘基其環境產生改變。NMR結構模擬結果顯示MP-B-NH2及9F-MP-B-NH2在30 % TFE溶液中，溫度283 K及310 K時，都在Lys4到Val13形成α螺旋結構，表示283K到310K的溫差還不足以對MP-B-NH2產生影響；而MP-B-COO-及9F-MP-B-COO-在溫度283K時，會在Lys4到Lys11及Ser5到Lys12形成α螺旋結構，但在310K時光譜則無法判定。
    Model-free分析13C的弛緩，其數據顯示胺化後的胜肽在溫度283 K時，其螺旋片段的動性都比未胺化的胜肽較低，因此我們推測由於C端自由基的影響，使得末端的胜肽分子結構不穩定，並影響了胜肽殘基與殘基之間的分子作用力，而造成去胺化的胜肽螺旋片段較短。
    從實驗結果發現抗菌胜肽C端胺化的修飾能夠使抗菌胜肽末端結構較為穩定，對於生物活性的影響也有非常大的改變。

Mastoparan B (MP-B) is an antimicrobial tetradecapeptide that was isolated from the hornet (Vespa basalis) venom with cationic character and amidated C-terminus.It forms a random coil in aqueous solution and adopts an amphiphilic α-helical conformation in trifluoroethanol(TFE). In this study, we investigate the structure, dynamic behavior and biological activity of Mastoparan-B and 9F-Mastoparan-B with and without C-terminal carboxyamidation.
Spectra of circular dichroism (CD) indicated that our peptides will form random coil conformation in aqueous solution, and an α-helical conformation in 30%TFE. The C-terminal carboxyamidation contributes significant difference in amide proton secondary chemical shifts, we conclude that the C-terminal carboxyamidation can provide additional H-bond that changed the local environment of nearby residues in C-terminal. The NMR data of MP-B-NH2 and 9F-MP-B-NH2 indicated the induced helix involves residues from 4 to 13 in 30% TFE at 283K and 310K. It shows that there is no influence in structure from 283K to 310K, while MP-B-COO- and 9F-MP-B-COO- helices involve residues respectively from 4 to 11 and 5 to 12 in 30% TFE 283K, but the spectra at 310K can not phase. 
In the model-free analysis of 13C relaxation data showed that based on order parameter, S2, the helix segment of MP-B-NH2 are more restricted than that of MP-B-COO-. We proposed that the free carboxyl group at C-terminal result in structure instability, and might destabilize not only the hydrogen bond stretch of helical structure but the peptide as a whole.
Antimicrobial peptides, the C-terminal carboxyaamidation of AMP can make the peptides become more stable, and has large influences in the biological activity.

目錄.......................................................I

表目錄.....................................................IV

圖目錄  .........................................................VII 
縮寫表 ..........................................................XX
第一章 緒論
1.1 抗菌胜肽簡介 ...........................................................1
1.2 Mastoparan家族 ...........................................................2
1.3 Mastoparan B (MP-B) 介紹 ...........................................................3
1.4研究目的 ...........................................................5
第二章 實驗原理
    2.1 固相胜肽合成 ...........................................................6
    2.2 圓二色旋光光譜儀原理 ...........................................................8
    2.3核磁共振 ..........................................................14
    2.4二維核磁共振 ..........................................................20
        2.4.1 COSY實驗 ..........................................................22
        2.4.2 TOCSY實驗 ..........................................................24
        2.4.3 NOESY實驗 ..........................................................25
        2.4.4 HSQC實驗 ..........................................................29
        2.4.5 DOSY實驗 ..........................................................30
    2.5 化學位移指數 ..........................................................34
    2.6 結構計算 ..........................................................35
    2.7無模型法則(Model-Free Approach) ..........................................................36
第三章 實驗材料與方法
    3.1 實驗材料 ..........................................................40
    3.2 實驗儀器 ..........................................................43
    3.3 實驗方法 ..........................................................47
        3.3.1 試劑配置 ..........................................................45
        3.3-2 胜肽合成 ..........................................................46
        3.3-3抗菌活性測試 ..........................................................47
        3.3-4 圓二色旋光光譜儀 ..........................................................49
        3.3-5 核磁共振實驗 ..........................................................50
        3.3-6 結構計算 ...................................................................52
        3.3-7 無模型法則(model-free approach)計算  ..........................................................55
        3.3-8 黏度測量 ..........................................................58
第四章 結果與討論
4.1 胜肽純化與分子量鑑定 ..........................................................59
4.2 抗菌活性 ..........................................................61
    4.3 圓二色旋光光譜 ..........................................................67
    4.4二維核磁共振光譜 ..........................................................75
    4.5 二次化學位移 .........................................................114
    4.6 結構計算 .........................................................119
    4.7 DOSY光譜	.........................................................129
    4.8 胜肽分子的動態行為 .........................................................138
    4.9 極性角度 .........................................................145
第五章 結 論 .........................................................146
第六章 參考文獻 .........................................................149

表目錄
表1-1：Mastoparan 家族序列圖。..........................................................3
表2-1 : CD 光譜-胜肽二級結構的吸收波長範圍。................................12
表2-2 : 連續及不連續的NOE可預測特定的二級結構。.....................28
表2-3： 20 種常見胺基酸在無序纏捲下，αH 的化學位移範圍。.........34
表3-1: 合成時所使用活化、偶合和去保護的時間。.............................46
表3-2：圓二色光譜儀的實驗參數。.....................................................49
表3-3：30% TFE-d3 / 70% H2O 樣品在283 K 時所設定的參數。....50
表3-4：MP-B-NH2 , 283 K 弛緩實驗的參數設定。............................51
表3-5：mfinput 變數。.............................................................................56
表4-1： HPLC純化的梯度條件設定。....................................................59
表4-2：MP-B-NH2 、MP-B-COO-、9F-MP-B-NH2 及9F-MP-B-COO-
對E. coli 的最低抑制濃度。......................................................65
表4-3：抗菌胜肽各濃度對大腸桿菌的抑制生長率。...........................65
表4-4: 胺基酸的疏水性值。.................................................................66
表4-5 : MP-B-NH2 及MP-B-COO-在0 % ~ 50% TFE 溶液中α-helix 含
量。............................................................................................73
表4-6： 9F-MP-B-NH2 及9F-MP-B-COO-在0 % ~ 50% TFE 溶液中α
-helix 含量。.............................................................................73
表4-7：MP-B-NH2、MP-B-COO-在30 % TFE 中，溫度283 K、298 K
及310 K 時α-helix 結構的含量。.......................................... 74
表4-8：9F-MP-B-NH2、9F-MP-B-COO-在30 % TFE 中，溫度283 K、
298 K 及310 K 時α-helix 結構的含量。...................................74
表4-9：MP-B-NH2，濃度3.7 mM，在30 % TFE-d3 / 70 % H2O 溶液中，
pH 4.08，溫度283 K 時的1H 化學位移表。.......................87
表4-10：MP-B-NH2，濃度3.7 mM，在30 % TFE-d3 / 70 % H2O 溶液
中，pH 4.08，溫度283 K時的13C化學位移表。......................88
表4-11：9F-MP-B-NH2，濃度3.7 mM，在30 % TFE-d3 / 70 % H2O 溶
液中，pH 4.08，溫度283 K 時的1H 化學位移表。................100
表4-12：MP-B-COO-，濃度3.7 mM，在30 % TFE-d3 / 70 % H2O 溶液
中，pH 4.08，溫度283 K 時的1H 化學位移表。..............106
表4-13：MP-B-COO-，濃度3.7 mM，在30 % TFE-d3 / 70 % H2O 溶液
中，pH 4.08，溫度283 K時的13C化學位移表。....................108
表4-14：9F-MP-B-COO-，濃度3.7 mM，在30 % TFE-d3 / 70 % H2O
溶液中，pH 4.08，溫度283 K時的1H化學位移表。...........113
表4-15：MP-B 與9F-MP-B，C 端胺化與未胺化20 個能量最低結構
的NOE數目及結構相關統計。...........................................128
表4-16：MP-B-NH2 在30 % TFE-d3 / 70 % H2O 的溶液中，各溫度下
的擴散系數(D)、溶液黏度(η) 及分子量。..........................134
表4-17：9F-MP-B-NH2 在30 % TFE-d3 / 70 % H2O 的溶液中，各溫度
下的擴散系數(D)、溶液黏度(η) 及分子量。......................135
表4-18：MP-B-COO-在30 % TFE-d3 / 70 % H2O 的溶液中，各溫度下
的擴散系數(D)、溶液黏度(η) 及分子量。........................136
表4-19：9F-MP-B-COO-在30 % TFE-d3 / 70 % H2O 的溶液中，各溫度
下的擴散系數(D)、溶液黏度(η) 及分子量。........................137
表4-20：MP-B-NH2 及MP-B-COO-在283K 時的全關聯時間τm 及整
條胜肽與螺旋片段的次序參數S2。......................................139
表4-21：MP-B-NH2 在30%TFE-d3/70%H2O 283K 下，R1、R2、NOE
弛緩實驗參數與次序參數S2。.............................................142
表4-22：MP-B-COO-在30%TFE-d3/70%H2O 283K 下，R1、R2、NOE
弛緩實驗參數與次序參數S2。.............................................143

圖目錄
圖1-1：MP-B 在TFE 下20 個能量最小的結構疊圖，從Leu3 到Leu14
形成α螺旋結構。......................................................................4
圖2-1：固相胜肽合成流程圖。..............................................................7
圖2-2：產生圓形偏極光的示意圖。.......................................................9
圖2-3：平面偏極光軌跡示意圖。..........................................................10
圖2-4：CD 光譜圖。..............................................................................12
圖2-5 : 原子核在磁場下產生的磁矩μ，頻率為ω。..............................15
圖2-6 : 原子在靜磁場中的能量分裂。.................................................15
圖2-7 : 原子核吸收RF pulse 能量，產生能階狀態的躍遷。............16
圖2-8：整個系統磁矩向量總和M0 示意圖。......................................16
圖2-9： M0 受電磁脈衝偏轉到XY 平面。............................................17
圖2-10：M0 在Z 軸與XY 平面弛緩的簡易圖。....................................18
圖2-11 : Mz’和Mx’-y’與T1、T2 關係式與關係圖。..................................19
圖2-12：二維核磁共振實驗的脈衝序列。............................................20
圖2-13：在二維核磁共振實驗中，將t1 做線性增加。..........................21
圖2-14：COSY 的脈衝序列。.............................................................. .22
圖2-15：TOCSY 的脈衝序列。.............................................................24
圖2-16：兩個偶極耦合的自旋，I 和S 的弛緩路徑，W0、W1 和W2
分別表示零量子、單量子和雙量子的躍遷。.....................25
圖2-17：兩個相鄰胺基酸之間質子的距離。......................................26
圖2-18：NOESY 的脈衝序列。...........................................................26
圖2-19：HSQC 的脈衝序列。..............................................................29
圖2-20：簡易的DOSY 脈衝序列。.....................................................31
圖2-21：局部與總體的物理模型示意圖。..........................................38
圖4-1：MP-B-NH2 經一次純化後的HPLC 層析圖。............................59
圖4-2：經由MALDI -TOF Mass 測得的分子量為1614.04。............60
圖4-3：理想中的劑量反應曲線。..........................................................62
圖4-4： MP-B-NH2 與MP-B-COO- 對E. coli的劑量反應曲線。.........64
圖4-5：9F- MP-B-NH2 與9F-MP-B-COO- 對E. coli 的劑量反應曲
線。.............................................................................................64
圖4-6：MP-B-NH2 在0%、10%、20%、30%、40%、50% TFE 溶液
中，溫度300 K的CD光譜圖。...................................................68
圖4-7：MP-B-COO-在0%、10%、20%、30%、40%、50% TFE 溶液
中，溫度300 K的CD光譜圖。...................................................69
圖4-8：9F-MP-B-NH2 在0%、10%、20%、30%、40%、50% TFE
液中，溫度300 K 的CD 光譜圖。..........................................69
圖4-9：9F-MP-B-COO-在0%、10%、20%、30%、40%、50% TFE 溶
液中，溫度300 K 的CD 光譜圖。............................................70
圖4-10：MP-B- NH2 在30 % TFE 溶液中，溫度283 K、298 K 及
310 K 的CD 光譜疊圖。.........................................................70
圖4-11：MP-B- COO-在30 % TFE 溶液中，溫度283 K、298 K 及
310 K 的CD 光譜疊圖。.............................................................71
圖4-12：9F-MP-B- NH2 在30 % TFE 溶液中，溫度283 K、298 K 及
310 K 的CD 光譜疊圖。.............................................................71
圖4-13：9F-MP-B- COO-在30 % TFE 溶液中，溫度283 K、298 K 及
310 K 的CD 光譜疊圖。.............................................................72
圖4-14：MP-B-NH2 在30 % TFE-d3 / 70 % H2O，283 K 的TOCSY 光
譜。............................................................................................76
圖4-15：MP-B-NH2 在30 % TFE-d3 / 70 % H2O，283 K 的NOESY 光
譜。顯示dαN(i, i+1)的NOE 連結。..........................................77
圖4-16：MP-B-NH2 在30 % TFE-d3 / 70 % H2O，283 K 的NOESY 光
譜。顯示dβN(i, i+1)的NOE 連結。.............................................78
圖4-17：MP-B-NH2 在30 % TFE-d3 / 70 % H2O，283 K 的NOESY 光
譜。顯示dNN(i, i+1)的NOE。......................................................79
圖4-18：MP-B-NH2 在30 % TFE-d3 /70 % H2O，283 K 的NOESY 光
譜。顯示dαN(i, i+3)、dαN(i, i+4)的NOE。............................ 80
圖4-19：MP-B-NH2 在30 % TFE-d3 / 70 % H2O，283 K 的NOESY 光
譜。顯示dβN(i, i+3)、dβN(i, i+4)的NOE。.............................81
圖4-20：MP-B-NH2 在30 % TFE-d3 / 70 % H2O，283 K 的NOESY 光
譜。顯示dαβ(i, i+3)的NOE。....................................................82
圖4-21：MP-B-NH2 在30 % TFE-d3 / 70 % H2O，283 K 的NOESY 光
譜。顯示Trp9 芳香環側鏈及C 端末端修飾的-NH2 與其它殘
基間的NOE。...........................................................................83
圖4-22：MP-B-NH2 在30% TFE-d3/70% H2O，283K 的NOESY 光譜。
顯示Leu14 及C 端末端修飾的-NH2 的NOE。.........................84
圖4-23：MP-B-NH2 在30 % TFE-d3 / 70 % H2O，溫度283 K 時的NOE
連結。用線的粗細分別來表示強、中、弱的NOE 訊號。..........85
圖4-24：MP-B-NH2 在30% TFE-d3/70% H2O，283K 的{1H}-13C HSQC
光譜。........................................................................................86
圖4-25：9F-MP-B-NH2 在30 % TFE-d3 / 70 % H2O，283 K 的TOCSY
光譜。.......................................................................................90
圖4-26：9F-MP-B-NH2 在30 % TFE-d3 / 70 % H2O，283 K 的NOESY
光譜。顯示dαN(i, i+1)的NOE 連結。........................................91
圖4-27：9F-MP-B-NH2 在30 % TFE-d3 / 70 % H2O，283 K 的NOESY
光譜。顯示dβN(i, i+1)的NOE 連結。........................................92
圖4-28：9F-MP-B-NH2 在30 % TFE-d3 / 70 % H2O，283 K 的NOESY
光譜。顯示dNN(i, i+1)的NOE。...............................................93
圖4-29：9F- MP-B-NH2 在30 % TFE-d3 /70 % H2O，283 K 的NOESY
光譜。顯示dαN(i, i+3)、dαN(i, i+4)的NOE。.............................94
圖4-30：9F-MP-B-NH2 在30 % TFE-d3 / 70 % H2O，283 K 的NOESY
光譜。顯示dβN(i, i+3)的NOE。.............................................95
圖4-31：9F-MP-B-NH2 在30 % TFE-d3 / 70 % H2O，283 K 的NOESY
光譜。顯示dαβ(i, i+3)的NOE。..................................................96
圖4-32：9F-MP-B-NH2 在30 % TFE-d3 / 70 % H2O，283 K 的NOESY
光譜。顯示Phe9 芳香環側鏈及C 端末端修飾的-NH2 與其它
殘基間的NOE。.........................................................................97
圖4-33：9F-MP-B-NH2 在30% TFE-d3/70% H2O，283K 的NOESY 光
譜。顯示Leu14 及C 端末端修飾的-NH2 的NOE。..................98
圖4-34：9F-MP-B-NH2 在30 % TFE-d3 / 70 % H2O，溫度283 K 時的
NOE 連結。用線的粗細分別來表示強、中、弱的NOE 訊
號。............................................................................................99
圖4-35：MP-B-COO-在30 % TFE-d3 / 70 % H2O，283 K 的TOCSY 光
譜。............................................................................................102
圖4-36：MP-B-COO-在30 % TFE-d3 / 70 % H2O，283 K 的NOESY 光
譜。顯示Trp9 芳香環側鏈與其它殘基間的NOE。.............103
圖4-37：MP-B-COO-在30 % TFE-d3 / 70 % H2O，283 K 的NOESY 光
譜。顯示dNN(i, i+1)的NOE。....................................................104
圖4-38：MP-B-COO-在30 % TFE-d3 / 70 % H2O，溫度283 K 時的NOE
連結。用線的粗細分別來表示強、中、弱的NOE 訊號。........105
圖4-39：MP-B-COO-在30% TFE-d3/70% H2O，283K 的{1H}-13C HSQC
光譜。........................................................................................107
圖4-40：9F-MP-B-COO-在30 % TFE-d3 / 70 % H2O，283 K 的TOCSY
光譜。......................................................................................109
圖4-41：9F-MP-B-COO-在30 % TFE-d3 / 70 % H2O，283 K 的NOESY
光譜。顯示Phe9 芳香環側鏈與其它殘基間的NOE。........110
圖4-42：9F-MP-B-COO-在30 % TFE-d3 / 70 % H2O，283 K 的NOESY
光譜。顯示dNN(i, i+1)的NOE。...............................................111
圖4-43：9F-MP-B-COO-在30 % TFE-d3 / 70 % H2O，溫度283 K 時的
NOE 連結。用線的粗細分別來表示強、中、弱的NOE 訊
號。............................................................................................112
圖4-44：MP-B-NH2 在283K 時殘基與無序纏繞的αH 化學位移差
值。............................................................................................115
圖4-45：9F-MP-B-NH2 在283K 時殘基與無序纏繞的αH 化學位移差
值。............................................................................................115
圖4-46：MP-B-COO-在283K 時殘基與無序纏繞的αH 化學位移差
值。...........................................................................................116
圖4-47：9F-MP-B-COO-在283K 時殘基與無序纏繞的αH 化學位移差
值。............................................................................................116
圖4-48：MP-B-NH2 與MP-B-COO-在283K 下各殘基與無序纏繞的
NH 化學位移差值。..................................................................117
圖4-49：9F-MP-B-NH2 與9F-MP-B-COO-在283K 下個殘基與無序纏
繞的NH 化學位移差值。......................................................118
圖4-50：(A)圖為MP-B-NH2 在283K 時，能量最小的20 個結構疊圖，
為殘基4-13 的主幹堆疊結構，(左邊為C 端，右邊為N 端)。
(B)圖為只顯示胜肽骨架的結構疊圖，(C)圖為20 個能量最小
的彩帶結構疊圖。...................................................................121
圖4-51： MP-B-NH2 在283K 時，能量最小的20 個結構的
Ramachandran Plot 圖，主要殘基座落在右旋的α-helix 區塊
上。............................................................................................122
圖4-52：(A)圖為9F-MP-B-NH2 在283K 時，能量最小的20 個結構疊
圖，為殘基4-13 的主幹堆疊結構，(左邊為C 端，右邊為N
端)。(B)圖為只顯示胜肽骨架的結構疊圖，(C)圖為20 個能量
最小的彩帶結構疊圖。............................................................123
圖4-53：9F-MP-B-NH2 在283K 時，能量最小的20 個結構的
Ramachandran Plot 圖，主要殘基座落在右旋的α-helix 區塊
上。..........................................................................................124
圖4-54：MP-B-NH2 與MP-B-COO- 能量最小的20 個胜肽骨架的結
構疊圖，分別為殘基4-13 及4-11，(左邊為C 端，右邊為N
端)。..........................................................................................125
圖4-55：9F- MP-B-NH2 與9F-MP-B-COO- 能量最小的20 個胜肽骨
架的結構疊圖，分別為殘基4-13 及5-12，(左邊為C 端，右邊
為N端)。.....................................................................................125
圖4-56：MP-B-NH2 與MP-B-COO- 在283K 時的彩帶結構圖，螺旋
片段為Lys4 到Val13 及Lys4 到Lys11。...................................126
圖4-57：9F-MP-B-NH2 與9F-MP-B-COO-在283K 時的彩帶結構圖，
螺旋片段為Lys4 到Val13 及Ser5 到Lys12。..........................126
圖4-58：MP-B-NH2 與9F-MP-B-NH2 在283K 時，形成H 鍵及氫鍵長
度的假想示意圖。......................................................................127
圖4-59 ： 濃度為3.7mM 的MP-B-NH2 在283K 下水溶液
30%TFE-d3/60%H2O 中， pH4.08 的條件下之DOSY 光譜
圖。..............................................................................................130
圖4-60 ： 濃度為3.7mM 的9F-MP-B-NH2 在283K 下水溶液
30%TFE-d3/60%H2O 中， pH4.9 的條件下之DOSY 光譜
圖。..............................................................................................131
圖4-61：MP-B-NH2 與MP-B-COO-在30%TFE-d3/70%H2O 溶液中，
不同溫度下的擴散係數。........................................................132
圖4-62：MP-B-NH2 與MP-B-COO-在30%TFE-d3/70%H2O 溶液中，
不同溫度下的自結合情形。.....................................................132
圖4-63：9F-MP-B-NH2 與9F-MP-B-COO-在30%TFE-d3/70%H2O 溶液
中，不同溫度下的擴散係數。....................................................133
圖4-64：9F-MP-B-NH2 與9F-MP-B-COO-在30%TFE-d3/70%H2O 溶液
中，不同溫度下的自結合情形。...............................................133
圖4-65：MP-B-NH2 與MP-B-COO-在30%TFE-d3/70%H2O 283K 下，
各殘基的弛緩實驗參數，R1、R2、NOE。................................140
圖4-66：MP-B-NH2 與MP-B-COO-在30%TFE-d3/70%H2O 283K 下，
各殘基的次序參數S2。.............................................................141
圖4-67 : MP-B-NH2(左圖)為所預測的雙性結構投影圖，(右圖)為
XPLOR 所計算出的α-helix 結構圖。........................................145
圖4-68 : MP-B-COO-(左圖)為所預測的雙性結構投影圖，(右圖)為
XPLOR 所計算出的α-helix 結構圖。........................................145

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