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系統識別號 U0002-1808200514074800
中文論文名稱 利用雙偏極化干涉術對乳鐵蛋白與鐵離子交互作用之構形變化研究
英文論文名稱 Studies of conformation change for interaction of lactoferrin and ferric ions by dual polarization interferometry (DPI).
校院名稱 淡江大學
系所名稱(中) 生命科學研究所碩士班
系所名稱(英) Graduate Institute of Life Sciences
學年度 93
學期 2
出版年 94
研究生中文姓名 吳榮信
研究生英文姓名 Rung-Shin Wu
學號 692290199
學位類別 碩士
語文別 中文
口試日期 2005-06-21
論文頁數 76頁
口試委員 指導教授-李世元
委員-林世明
委員-王伯昌
委員-林啟萬
委員-黃榮山
中文關鍵字 雙偏極化干涉術  乳鐵蛋白 
英文關鍵字 dual polarization interferometry(DPI)  Lactoferrin 
學科別分類 學科別醫學與生命科學生物學
中文摘要 本實驗以雙偏極化干涉術(DPI)量測鐵離子與乳鐵蛋白結合或是解離時所引發的蛋白質構形、厚度、密度、表面濃度(質量)等變化,得到當鐵離子與乳鐵蛋白進行解離反應時,DPI晶片上的乳鐵蛋白的構形變化為厚度減少、密度增加;當鐵離子與乳鐵蛋白進行結合反應時,則為厚度增加、密度減少,此結果可能與乳鐵蛋白固定在DPI晶片表面時屬於亂相固定有關。本實驗由乳鐵蛋白中解離出鐵離子的方法為外加pH為2.2的酸性緩衝液(Glycine-HCl buffer);而與乳鐵蛋白結合的鐵離子則採用氯化鐵(FeCl3)水溶液。本實驗更提出乳鐵蛋白構形變化程度與所加入之鐵離子濃度倍數的關係,當加入的鐵離子之濃度增加時,乳鐵蛋白其厚度次序增加,但密度次序減少,且當加入鐵離子濃度倍數達到20-50倍(48.6~121.5 μM)時,鐵離子與乳鐵蛋白之間結合會有飽和現象。
英文摘要 In this study, we use the dual polarization interfereometry (DPI) to measure the difference of lactoferrin protein after or before treated by iron ion. The parameters of conformation change of lactoferrin, surface concentration, thickness change and density on chip can be determined by Maxwell methods. We also show the relationship of conformation change of lactoferrin proteins with the iron ion concentrations. When iron ion is dissociated from lactoferrin, conformation change of lactoferrin on DPI chip is thickness decrease and density increase, and when iron ion is associated from lactoferrin, conformation change of lactoferrin on DPI chip is thickness increase and density decrease. This results may be correlated with non-specific immobilization. When iron ion concentrations is 48.6~121.5 μM, the association between iron ion and lactoferrin will be saturated. The dynamic parameters of lactoferrin bind to iron ion can be determined by the molecule dynamic model.
論文目次 目錄
中文摘要 I
英文摘要 II
目錄 III
圖目錄 VI
表目錄 XI
第ㄧ章 序論 1
1-1 前言 1
1-2 文獻回顧 5
1-3 蛋白質構形與摺疊之研究 8
1-4 乳鐵蛋白介紹 11
1-5 生物感測晶片之簡介 13
1-6 光學生物感測器 16
1-7 Dual Polarisation Interferometry(DPI)基本架構與量測原理 17
1-8 自我組裝單分子層(Self-assembly monolayer, SAM) 25
1-9 RCA矽晶圓洗淨法 27
1-10 乳鐵蛋白與鐵離子間平衡常數—理論模型 29
1-11 研究背景及重要性 32
第二章 實驗部份 38
2-1 晶片表面蛋白質分子結合技術 38
2-2 藥品與儀器 40
2-2-1 實驗藥品 40
2-2-2 實驗儀器 41
2-3 藥品製備 42
2-3-1 藥品配置 42
2-3-2 緩衝液配置 43
2-3-3 乳鐵蛋白樣本除去鐵離子的前處理步驟 45
2-3-4 晶片表面修飾 46
2-4 利用雙偏極化干涉術(DPI)量測乳鐵蛋白之實驗步驟 48
2-4-1 決定晶片表面形成單分子層膜乳鐵蛋白所需的注射濃度 48
2-4-2 以不同酸鹼度(pH value)的緩衝液(buffer)處理晶片表面的乳鐵蛋白 51
2-4-3 分別以不同濃度倍數( 1、2、5、10、20、50、100倍,1倍的氯化鐵水溶液=2.43 μM )的氯化鐵水溶液處理晶片表面的乳鐵蛋白 52
第三章 實驗結果與討論 54
3-1 氯化鐵溶液配置相關討論 54
3-2 乳鐵蛋白於晶片表面之構形變化 55
3-2-1 以不同pH值的緩衝液處理晶片表面的乳鐵蛋白 55
3-2-2 以不同濃度倍數的氯化鐵水溶液處理晶片表面的乳鐵蛋白 61
3-3 乳鐵蛋白與鐵離子作用之質量變化 65
3-4 結論 69
附錄 70

圖目錄
圖 一 遠場光學生物感測器(DUAL POLARIZATION INTERFEROMETRY)外觀圖(7)。 4
圖 二 位置專一性固定法(SITE-SPECIFIC IMMOBILIZATION)與非專一性固定法(NON-SPECIFIC IMMOBILIZATION)的結合位置比較圖(8) (9)。 6
圖 三 在酸鹼值改變下乳鐵蛋白與輸鐵蛋白內部之鐵離子釋放的情形(11)。 10
圖 四 標準乳鐵蛋白的完全形式(HOLO FORM)之聚胜肽鏈摺疊示意圖(1)。 12
圖 五 楊氏干涉條紋光譜(YOUNG’S FRINGE PATTERN)之現象(15)。 18
圖 六 正通過波導(WAVEGUIDE)的光波與漸逝波(EVANESCENT WAVE)圖(15)。 19
圖 七 漸逝波(EVANESCENT WAVE)波形相位延遲示意圖(15)。 19
圖 八 遠場光學生物感測器(DUAL POLARIZATION INTERFEROMETRY)儀器模型流程圖(7) 22
圖 九 遠場光學生物感測器(DPI)的光學感測晶片(SENSOR CHIP)及其載台(CARRIER)圖。 22
圖 十 DPI光學感測晶片外觀結構圖。 23
圖 十一 雙厚層波導干涉儀,DUAL SLAB WAVEGUIDE INTERFEROMETER (7)。 23
圖 十二 SELF-ASSEMBLY MONOLAYERS 之成形步驟示意圖(16)。 26
圖 十三 FE3+ - LACTOFERRIN INTERACTION KINETICS AT SOLID-LIQUID INTERFACE。 31
圖 十四 在輸鐵蛋白和乳鐵蛋白上的標準鐵離子結合位,殘基標號為相對於牛之乳鐵蛋白(BOVINE LACTOFERRIN)的N-LOBE (1)。 33
圖 十五 人類乳鐵蛋白(HUMAN LACTOFERRIN) N-LOBE之鐵離子結合位(11)。 34
圖 十六 在鐵離子釋放狀態下乳鐵蛋白的構形改變,圖上顯示之結構為HUMAN APO-LACTOFERRIN兩葉都呈現打開(OPEN)的狀態(11)。 35
圖 十七 在鐵離子釋放狀態下乳鐵蛋白的構形改變,圖上四個不同的結構皆為乳鐵蛋白打開(OPEN)的狀態(11)。 35
圖 十八 乳鐵蛋白構形變化示意圖,圖上所顯示之模型為溶液狀態下 APO 形式的乳鐵蛋白所可能存在的結構(1)。 36
圖 十九 輸鐵蛋白與鐵離子結合的模型圖(11)。 37
圖 二十 晶片表面蛋白質分子結合技術之連接子(LINKER)反應流程圖。 39
圖 二十一 藉由遠場光學生物感測器(DPI)所得到的實驗2-4-1RAW DATA。 48
圖 二十二 乳鐵蛋白結合在DPI晶片上時所量測得到的的TM、TE變化圖。 49
圖 二十三乳鐵蛋白結合在DPI晶片上時所量測得到的的厚度、密度變化圖。 49
圖 二十四 乳鐵蛋白結合在DPI晶片上時所量測得到的的質量變化圖。 49
圖 二十五 加入不同濃度的乳鐵蛋白至DPI晶片後,得到乳鐵蛋白濃度對表面濃度(質量)增加值折線圖。 50
圖 二十六 藉由遠場光學生物感測器(DPI)所得到的實驗步驟2-4-2 RAW DATA。 51
圖 二十七 藉由遠場光學生物感測器(DPI)所得到的實驗步驟2-4-3 RAW DATA。 52
圖 二十八 本實驗步驟的設計循環圖。 53
圖 二十九 配置ㄧ小時之氯化鐵溶液。 54
圖 三十 靜置三天之氯化鐵溶液。 54
圖 三十一 牛的乳鐵蛋白、人類乳鐵蛋白與人類血清輸鐵蛋白個別在酸鹼值改變下內部之鐵離子釋放的情形(1)。 56
圖 三十二 藉由遠場光學生物感測器量測,流經不同緩衝範圍(PH值)之緩衝液的DPI晶片上乳鐵蛋白的厚度變化。 56
圖 三十三 藉由遠場光學生物感測器量測,流經不同緩衝範圍(PH值)之緩衝液的DPI晶片上乳鐵蛋白的密度變化。 57
圖 三十四 流經不同緩衝範圍(PH值)之緩衝液的DPI晶片上乳鐵蛋白的厚度及密度變化差值圖。 59
圖 三十五 生物分子反應之厚度(尺寸)及密度量測關係圖(15)。 59
圖 三十六 DPI晶片上乳鐵蛋白呈現CLOSED FORM之示意圖。 60
圖 三十七 DPI晶片上乳鐵蛋白呈現OPEN FORM之示意圖。 60
圖 三十八 藉由遠場光學生物感測器量測,流經不同濃度倍數的氯化鐵水溶液的DPI晶片上乳鐵蛋白之厚度變化。 62
圖 三十九 藉由遠場光學生物感測器量測,流經不同濃度倍數的氯化鐵水溶液的DPI晶片上乳鐵蛋白之密度變化。 62
圖 四十 不同濃度倍數的鐵離子對加入鐵離子之後所造成的厚度參數差作圖。 64
圖 四十一 不同濃度倍數的鐵離子對加入鐵離子之後所造成的質量參數差作圖。 66
圖 四十二 藉由遠場光學生物感測器量測,流經不同濃度倍數的氯化鐵水溶液的DPI晶片上乳鐵蛋白之質量(表面濃度)變化。 67
圖 四十三 藉由遠場光學生物感測器量測,流經不同濃度倍數的氯化鐵水溶液的DPI晶片上乳鐵蛋白之質量(表面濃度)變化。 68
圖 四十四 TREAT WITH DIFFERENT PH BUFFER (PH=1.0, 1.2…4.0, 4.2) 70
圖 四十五 藉由遠場光學生物感測器量測,流經不同濃度倍數的氯化鈣水溶液的DPI晶片上乳鐵蛋白之厚度變化。 71
圖 四十六 藉由遠場光學生物感測器量測,流經不同濃度倍數的氯化鈣水溶液的DPI晶片上乳鐵蛋白之密度變化。 72
圖 四十七 藉由遠場光學生物感測器量測,流經不同濃度倍數的氯化鈣水溶液的DPI晶片上乳鐵蛋白之質量變化。 73
圖 四十八 SURFACE CHARGE ON THE HUMAN LACTOFERRIN MOLECULE (6)。 73
圖 四十九 晶片表面蛋白質結合示意圖。 74

表目錄
表 一 雙偏極化干涉術與其他常用光學生物感測技術之特性與優缺點比較表(7)。 2
表 二 RCA的矽晶圓洗淨法。 28
表 三 天然(NATIVE)與重組(RECOMBINANT)輸鐵蛋白鐵離子釋放之酸鹼度臨界值(11)。 37
表 四 在注入不同鐵離子濃度倍數下,遠場光學生物感測器所測得鐵離子加入後的厚度參數差表。 63
表 五 在注入不同鐵離子濃度倍數下,遠場光學生物感測器所測得鐵離子加入後的質量參數差表。 65
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