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系統識別號 U0002-1802200914513100
中文論文名稱 利用CD 和NMR 研究合成的神經胜肽片段 hNPY(18-26)之摺疊結構
英文論文名稱 Folding structure of synthesized neuropeptide segment hNPY (18-26) by CD and NMR
校院名稱 淡江大學
系所名稱(中) 化學學系碩士班
系所名稱(英) Department of Chemistry
學年度 97
學期 1
出版年 98
研究生中文姓名 方智民
研究生英文姓名 Chih-Ming Fang
學號 694171124
學位類別 碩士
語文別 中文
第二語文別 英文
口試日期 2009-01-12
論文頁數 134頁
口試委員 指導教授-李長欣
委員-錢嘉琳
委員-鄧金培
中文關鍵字 神經胜肽  胜肽合成法  核磁共振  化學位移指數  擴散係數 
英文關鍵字 NPY  SPPS  CD  NMR  CSI  Diffusion coefficient 
學科別分類 學科別自然科學化學
中文摘要 神經胜肽是神經胜肽家族的成員之ㄧ,在1982 年,首次從豬的
大腦出分離出來。神經胜肽家族的成員均含有36 個胺基酸,C 端皆
修飾為NH2,並且含有大量的Tyr、Pro 和Arg。神經胜肽主要分布
在中樞神經以及末梢神經系統中,並且控管許多重要的生理功能。
本論文利用固相胜肽合成儀合成hNPY (18-26),經由高效能液相層
析儀純化,質譜儀卻認分子量,再利用圓二色旋光光譜和核磁共振
光譜觀察不同比例TFE溶液下,二級結構的變化。此外,還利用DOSY
實驗觀察hNPY (18-26)在TFE 溶液中,自身結合的狀態。
從CD 實驗中,發現hNPY (18-26)在70% TFE 溶液中最具有結
構性;NMR 實驗判定hNPY (18-26)所有氫質子的化學位移。經由
NOE 限制條件分別計算hNPY (18-26)在10% D2O 與70% TFE-d3 溶
液中的三維結構,可發現在10% D2O 溶液呈現無序纏捲,70% TFE-d3
溶液則在Arg19 到Ser22 出現螺旋結構;DOSY 實驗確定了hNPY
(18-26) 在70% TFE-d3 溶液中主要以單體的型式存在。
配合CD、NMR 以及結構計算,討論不同比例TFE 溶液下,hNPY
(18-26)的結構差異,並且與完整的NPY 結構比較。
英文摘要 Neuropeptide Y (NPY), a member of the neuropeptide Y family of hormones, was
first isolated from porcine brain in 1982 (Tatemoto et al. 1982). The peptides of this
family all contain 36 amino acid residues, are C-terminally amidated, and contain a
rather high content of tyrosine, proline and arginine residues. NPY is a very abundant
neurotransmitter in the central and peripheral nervous system, and has been implicated
in several functions. Herein, we synthesize neuropeptide segment hNPY (18-26) by
SPPS, purified by RP-HPLC and made sure the molecular weight by Mass. The
conformation and dynamics of hNPY (18-26) in difference solvent condition is studied
by CD and NMR. We also defined the self-association state of hNPY (18-26) in TFE
solution by DOSY experiment.
The CD experiment, we can find the best helical conformation of hNPY18-26 at
70% TFE concentration. NMR experiments of COSY, TOCSY, ROESY, NOESY and
HSQC were acquired. With NOE restrained structural calculation, the major structure
of hNPY (18-26) in 10% D2O is random coil and form regular -helical structure
between Arg19 and Ser22 in 70% TFE-d3.
Combination od CD, NMR and XPLOR molecular calculation, we can investigate
the conformational difference between 10 % D2O and 70% TFE-d3 and compare with
native NPY.
論文目次 目錄
目錄 I
表目錄 III
圖目錄 V
第一章 序論 1
1.1 神經胜肽家族 1
1.2 PP、PYY 和NPY 在水溶液中的結構 4
1.3 PP、PYY 和NPY 與micelle 結合的結構 6
1.4 研究目的 9
第二章 實驗原理 10
2.1 固相胜肽合成法 10
2.2 圓二色旋光光譜儀 14
2.3 二維核磁共振 20
2.3-1 COSY 實驗 22
2.3-2 DQF-COSY 實驗 24
2.3-3 TOCSY 實驗 25
2.3-4 NOESY 實驗 26
2.3-5 HSQC 實驗 28
2.3-6 DOSY 實驗 30
2.4 化學位移指數 32
第三章 實驗材料與方法 35
3.1 胜肽的合成 36
3.2 胜肽的純化與鑑定 42
3.3 圓二色旋光實驗 45
3.4 核磁共振實驗 48
第四章 實驗結果 52
4.1 圓二色旋光光譜 52
4.2 核磁共振光譜 57
4.2-1 hNPY (18-26)在10% D2O,溫度300K 57
4.2-2 hNPY (18-26)在70% TFE-d3,溫度285K 61
4.2-3 hNPY (18-26)在70% TFE-d3,溫度300K 62
4.2-4 hNPY (18-26)在70% TFE-d3,溫度310K 64
4.3 化學位移指數的預測 65
4.4 在70% TFE-d3 的DOSY 光譜 69
第五章 討論 123
第六章 結論 132
第七章 參考資料 133

表目錄
表1-1:hNPY、hPYY、hPP 的胺基酸序列。 2
表1-2:Y receptors 與NPY 家族胜肽的結合程度及生理反應。 2
表2-1:20 種常見的胺基酸在無序纏捲下,αH 的化學位移範圍。 34
表2-2:20 種常見的胺基酸在無序纏捲下,αC、CO 和βC 的化學位移範圍。34
表3-1:去保護和耦合的反應時間 40
表3-2:合成12.5*10-5 莫爾hNPY (18-26)所需要的resin、胺基酸和PyBOP
的使用量。
40
表3-3:HPLC 純化的梯度,一針18 分鐘。 44
表3-4:圓二色旋光光譜儀實驗參數。 47
表3-5:10% D2O at 300K 的NMR 實驗參數。 50
表3-6:70% TFE-d3 at 285K 的NMR 實驗參數。 50
表3-7:70% TFE-d3 at 300K 的NMR 實驗參數。 51
表3-8:70% TFE-d3 at 310K 的NMR 實驗參數。 51
表4-1:hNPY (18-26)在10% D2O / 90% H2O,300K,pH 3,的1H 化學位
移。
116
表4-2:hNPY (18-26)在70% TFE-d3 / 30% H2O,285K,pH 2.6,的1H 化學
位移。
117
表4-3:hNPY (18-26)在70% TFE-d3 / 30% H2O,300K,pH 2.6,的1H 化學118

位移。
表4-4:hNPY (18-26)在70% TFE-d3 / 30% H2O,310K,pH 2.6,的1H 化學
位移。
119
表4-5:hNPY (18-26)在10% D2O / 90% H2O,300K,pH 3,的13C 化學位
移。
120
表4-6:hNPY (18-26)在70% TFE-d3 / 30% H2O,300K,pH 2.6,的13C 化
學位移。
121
表4-7:hNPY (18-26)在70% TFE-d3 / 30% H2O,pH 2.6 於各種溫度下的擴
散係數、黏度和分子量(Mexp 為實驗值、M 為理論值)。
122

圖目錄
圖1.1:aPP 的X-ray 繞射結晶結構。 3
圖1.2:由左至右為pPYY、pNPY、bPP 在水溶液中的單體結構。 5
圖1.3:bPP 在水溶液中的雙體結構。 5
圖1.4:pNPY 在水溶液中的雙體結構。 6
圖1.5:PP 與micelle 結合後,20 個能量最小化的結構疊圖。 7
圖1.6:PYY 與micelle 結合後,20 個能量最小化的結構疊圖。 7
圖1.7:NPY 與micelle 結合進而與receptors 作用的機制。 8
圖1.8:NPY 與micelle 結合後,20 個能量最小化的結構疊圖。 8
圖2.1:苯乙烯和二乙烯苯所聚合的高分子固態樹脂。 11
圖2.2:胺基酸的胺基和下一個胺基酸的羧基形成醯胺鍵。 11
圖2.3:鹼性條件下去除Fmoc 保護基的反應機制。 11
圖2.4:酸性條件下去除t-BOC 保護基的反應機制。 11
圖2.5:固相胜肽合成法流程圖。 13
圖2.6:Ninhydrin test 反應機制。 14
圖2.7:Ninhydrin test 呈色反應。 14
圖2.8:產生圓形偏極光的示意圖。 15
圖2.9:平面偏極光的偏轉。 16
圖2.10:蛋白質或胜肽的四種主要結構的圓二色旋光光譜。 19
圖2.11:α-helix、β-sheet、random coil、PP II的CD光譜。 20
圖2.12:二維核磁共振實驗的脈衝序列。 20
圖2.13:在二維核磁共振實驗中,將t1 做線性增加。 21
圖2.14:COSY 的脈衝序列。 23
圖2.15:DQF-COSY 的脈衝序列。 24
圖2.16:TOCSY 的脈衝序列。 25
圖2.17:兩個偶極偶合的自旋,I 和S 的弛緩路徑。 26
圖2.18:NOESY 的脈衝序列。 27
圖2.19:HSQC 的脈衝序列。 29
圖2.20:DOSY 的脈衝序列。 31
圖3.1:Rink Amide AM Resin 的結構式。 41
圖3.2:左邊藍色區塊為N 端的Fmoc 保護基。 41
圖3.3:PyBOP 與HBTU 的結構式。 41
圖3.4:PyBOP 形成離去基的反應機制。 41
圖3.5:切除試劑的選擇流程圖。 42
圖3.6:HPLC 純化的光譜。 44
圖3.7:電灑游離質譜圖顯示hNPY (18-26)的分子量為1134。 45
圖3.8:圓二色旋光光譜儀的裝置圖。 48
圖4.1:hNPY (18-26)在0% TFE 到40% TFE 溶液的CD 光譜疊圖。 53
圖4.2:hNPY (18-26)在50% TFE 到90% TFE 溶液的CD 光譜疊圖。 54
圖4.3:hNPY (18-26)在0% TFE 和70% TFE 溶液的CD 光譜疊圖。 55
圖4.4:hNPY (18-26)在0% TFE 到90% TFE 溶液的二級結構組成。 56
圖4.5:hNPY (18-26)在10% D2O / 90% H2O,300K,pH 3 的COSY 光譜
和TOCSY 光譜。
72
圖4.6:hNPY (18-26)在10% D2O / 90% H2O,300K,pH 3 的COSY 光譜
和TOCSY 光譜。
74
圖4.7:hNPY (18-26)在10% D2O / 90% H2O,300K,pH 3 的TOCSY 光譜。76
圖4.8:hNPY (18-26)在10% D2O / 90% H2O,300K,pH 3 的ROESY 光譜。77
圖4.9:hNPY (18-26)在10% D2O / 90% H2O,300K,pH 3 的ROESY 光譜。78
圖4.10:hNPY (18-26)在10% D2O / 90% H2O,300K,pH 3 的ROESY 光
譜。
79
圖4.11:hNPY (18-26)在10% D2O / 90% H2O,300K,pH 3 的[13C, 1H]-HSQC
光譜。
80
圖4.12:hNPY (18-26)在10% D2O / 90% H2O,300K,pH 3 的[13C, 1H]-HSQC
光譜。
81
圖4.13:hNPY (18-26)在10% D2O / 90% H2O,300K,pH 3 的[13C, 1H]-HSQC
光譜。
82
圖4.14:hNPY (18-26)在70% TFE-d3 / 30% H2O,285K,pH 2.6 的TOCSY 83
光譜。
圖4.15:hNPY (18-26)在70% TFE-d3 / 30% H2O,300K,pH 2.6 的TOCSY
光譜。
84
圖4.16:hNPY (18-26)在70% TFE-d3 / 30% H2O,310K,pH 2.6 的TOCSY
光譜。
85
圖4.17:hNPY (18-26)在70% TFE-d3 / 30% H2O,285K,pH 2.6 的NOESY
光譜。
86
圖4.18:hNPY (18-26)在70% TFE-d3 / 30% H2O,285K,pH 2.6 的NOESY
光譜。
87
圖4.19:hNPY (18-26)在70% TFE-d3 / 30% H2O,300K,pH 2.6 的NOESY
光譜。
88
圖4.20:hNPY (18-26)在70% TFE-d3 / 30% H2O,310K,pH 2.6 的NOESY
光譜。
89
圖4.21:hNPY (18-26)在70% TFE-d3 / 30% H2O,310K,pH 2.6 的NOESY
光譜。
90
圖4.22:hNPY (18-26)在70% TFE-d3 / 30% H2O,285K,pH 2.6 的NOESY
光譜。
91
圖4.23:hNPY (18-26)在70% TFE-d3 / 30% H2O,285K,pH 2.6 的NOESY
光譜。
92
圖4.24:hNPY (18-26)在70% TFE-d3 / 30% H2O,300K,pH 2.6 的NOESY
光譜。
93
圖4.25:hNPY (18-26)在70% TFE-d3 / 30% H2O,300K,pH 2.6 的NOESY
光譜。
94
圖4.26:hNPY (18-26)在70% TFE-d3 / 30% H2O,310K,pH 2.6 的NOESY
光譜。
95
圖4.27:hNPY (18-26)在70% TFE-d3 / 30% H2O,310K,pH 2.6 的NOESY
光譜。
96
圖4.28:hNPY (18-26)在70% TFE-d3 / 30% H2O,285K,pH 2.6 的NOESY
光譜。
97
圖4.29:hNPY (18-26)在70% TFE-d3 / 30% H2O,300K,pH 2.6 的NOESY
光譜。
98
圖4.30:hNPY (18-26)在70% TFE-d3 / 30% H2O,310K,pH 2.6 的NOESY
光譜。
99
圖4.31:hNPY (18-26)在70% TFE-d3 / 30% H2O,285K,pH 2.6 的NOESY
光譜。
100
圖4.32:hNPY (18-26)在70% TFE-d3 / 30% H2O,300K,pH 2.6 的NOESY
光譜。
101
圖4.33:hNPY (18-26)在70% TFE-d3 / 30% H2O,310K,pH 2.6 的NOESY 102
光譜。
圖4.34:hNPY (18-26)在70% TFE-d3 / 30% H2O,300K,pH 2.6 的[13C,
1H]-HSQC 光譜。
103
圖4.35:hNPY (18-26)在70% TFE-d3 / 30% H2O,300K,pH 2.6 的[13C,
1H]-HSQC 光譜。
104
圖4.36:hNPY (18-26)在70% TFE-d3 / 30% H2O,300K,pH 2.6 的[13C,
1H]-HSQC 光譜。
105
圖4.37:hNPY (18-26)在70% TFE-d3 / 30% H2O,pH 2.6 於283K、285k、
290K、295K、300K、305K、310K 的DOSY 光譜疊圖。
106
圖4.38:hNPY (18-26)在70% TFE-d3 / 30% H2O,pH 2.6 於283K、285k、
290K、295K、300K、305K、310K 的擴散係數與溫度作圖。
107
圖4.39:hNPY (18-26)在70% TFE-d3 / 30% H2O,pH 2.6 於283K、285K、
290K、295K、300K、305K、310K 的溶液黏度與溫度作圖。
107
圖4.40:hNPY (18-26)在70% TFE-d3 / 30% H2O,pH 2.6 於283K、285K、
290K、295K、300K、305K、310K 的分子量與溫度作圖。
108
圖4.41:hNPY (18-26)在10% D2O / 90% H2O,300K,pH 3,所有NOE 連
結。
108
圖4.42:hNPY (18-26)在70% TFE-d3 / 30% H2O,285K,pH 2.6,所有NOE
連結。
109
圖4.43:hNPY (18-26)在70% TFE-d3 / 30% H2O,300K,pH 2.6,所有NOE
連結。
110
圖4.44:hNPY (18-26)在70% TFE-d3 / 30% H2O,310K,pH 2.6,所有NOE
連結。
110
圖4.45:hNPY (18-26)在10% D2O / 90% H2O,溫度為300K,pH 3 的αH
化學位移差。
111
圖4.46:hNPY (18-26)在70% TFE-d3 / 30% H2O,溫度為285K,pH 2.6 的
αH 化學位移差。
111
圖4.47:hNPY (18-26)在70% TFE-d3 / 30% H2O,溫度為300K,pH 2.6 的
αH 化學位移差。
112
圖4.48:hNPY (18-26)在70% TFE-d3 / 30% H2O,溫度為310K,pH 2.6 的
αH 化學位移差。
112
圖4.49:hNPY (18-26)在10% D2O / 90% H2O 與70% TFE-d3 / 30% H2O 的
αH 化學位移差。
113
圖4.50:hNPY (18-26)在10% D2O / 90% H2O,溫度為300K,pH 3 的αC
化學位移差。
113
圖4.51:hNPY (18-26)在70% TFE-d3 / 30% H2O,溫度為300K,pH 2.6 的
αC 化學位移差。
114
圖4.52:hNPY (18-26)在10% D2O / 90% H2O,溫度為300K,pH 3 的βC 114
化學位移差。
圖4.53:hNPY (18-26)在70% TFE-d3 / 30% H2O,溫度為300K,pH 2.6 的
βC 化學位移差。
115
圖5.1:hNPY (18-26)在70% TFE-d3 / 30% H2O,溫度為285K,pH 2.6經由
XPLOR計算,包括模擬焠熄與能量最小化所得到的15個主幹推疊結構。
127
圖5.2:hNPY (18-26)在70% TFE-d3 / 30% H2O,溫度為285K,pH 2.6 的
三維結構。
127
圖5.3:hNPY (18-26)在70% TFE-d3 / 30% H2O,溫度為285K,pH 2.6的15
個模擬焠熄與能量最小化的結構的Ramachandran plot圖示。
128
圖5.4:hNPY (18-26)在70% TFE-d3 / 30% H2O,溫度為310K,pH 2.6 經
由XPLOR計算,包括模擬焠熄與能量最小化所得到的15 個主幹推疊結構。
129
圖5.5:hNPY (18-26)在70% TFE-d3 / 30% H2O,溫度為310K,pH 2.6 的
三維結構。
129
圖5.6:hNPY (18-26)在70% TFE-d3 / 30% H2O,溫度為310K,pH 2.6 的
15 個模擬焠熄與能量最小化的結構的Ramachandran plot 圖示。
130
圖5.7:hNPY (18-26)在70% TFE-d3 / 30% H2O,溫度為285K,pH 2.6 的
側鏈位置圖。
131
圖5.8:hNPY (18-26)在70% TFE-d3 / 30% H2O,溫度為310K,pH 2.6 的
側鏈位置圖。
131
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