人類神經胜肽Y(Human Neuropeptide Y, hNPY)在水溶液中具有α-螺旋結構，且低濃度下結構為單體，高濃度時則為雙體。其結構有特定作用機制:單體下先與膜微脂粒(membrane micelle)結合後進一步與GPCRs(G protein-coupled receptors)作用。
固相胜肽合成法(Solid Phase Peptide Synthesis)合成hNPY片段序列(hNPY[21-31])，經由高效能液相層析儀純化，質譜儀確認分子量，再用圓二色光譜(Circular Dichroism)觀察不同比例TFE溶液下，二級結構的變化，選擇100%水溶液與50%TFE兩溶液做結構測量與討論。用二維核磁共振(two-dimensional NMR)的光譜: COSY、TOCSY、ROESY、NOESY、[1H, 13C]-HSQC及光譜判定(Assignment)和光譜循序判定(Sequential assignment)，各別判定兩溶液之11個殘基質子與13碳的化學位移。經由NOE限制條件分別計算兩溶液之3D結構，100%水溶液呈現鬆散不規則結構，50%TFE溶液則在24Leu~28Asn出現α-螺旋結構。
配合CD、CSI(Chemical Shift Index)、NMR、結構計算，討論兩比例溶液之結構差異，並與NPY結構比較。

Human Neuropeptide Y(hNPY) has a well-defined α-helical structure in solution, and is monomer at low concentration, dimer at high concentration. It has specific binding mechanism: First, the monomer structure binds with membrane micelle, and further interacts with G protein-coulpled receptors(GPCRs).
We synthesize neuropeptide fragment hNPY[21-31] by solid phase peptide synthesis, purified by RP-HPLC and made sure the molecular weight by Mass. The conformation and dynamics of hNPY[21-31] in difference solvent condition is studied by CD and 2D NMR experiment.
2D NMR experiments of COSY, TOCSY, ROESY, NOESY, and [1H, 13C]-HSQC were acquired. With NOE restrained structural calculation, the major structure of hNPY[21-31] in 100% H2O is random coil and form regular α-helical structure between 24Leu and 28Asn in 50%TFE/50% H2O.
Combination of CD, NMR, and XPLOR molecular calculation, we can investigate the conformational difference between 100%H2O and 50%TFE /50%H2O, and compare with native NPY.

目錄

一、緒論                                               1
1.1 NPY家族                                          1
1.2 NPY在水溶液與膜微脂粒中結構變化                  2
1.3 研究目的                                              3

二、原理                                               6
2.1固相胜肽合成法                                     6
2.2-1圓二色光譜儀測量                                    10
2.2-2 蛋白質或多胜肽之圓二色光譜	13
2.3 二維核磁共振原理	15
2.3-1 COSY光譜	16
2.3-2 TOCSY光譜	17
2.3-3 NOESY實驗	17
2.4化學位移指數	23

三、實驗之材料與方法	26
3.1材料	26
3.2方法	32

四、結果	45

五、討論	109

六、參考資料	123






























圖片索引
圖1.1: NPY家族序列與結構圖示。                           4
圖1.2: 左為bPP，右為pNPY之水溶液三級結構圖。            4
圖1.3:pNPY水溶液之兩種雙體結構。                 4
圖1.4: pNPY單體與micelle結合後之17個結構計算疊圖。        5
圖1.5: pNPY與micelle結合流程圖。                          5
圖2.1 :固相胜肽合成法示意圖。                              8 
圖2.2: 去除保護基之流程圖。                                9 
圖2.3: Ninhydrin Test反應機制。                              9   
圖2.4: 光之振動電場(E)與磁場(M)示意圖。                    12
圖2.5: 光通過平面極化器(polarized)之示意圖。                 12
圖2.6: 左、右旋圓偏極光之合成圖。                          13
圖2.7:蛋白質之各種二級結構在圓二色光譜儀上的吸收圖。       14
圖2.8: 二維核磁共振實驗脈衝序列之四個時期。                19
圖2.9: 演化期之t1 值線性增加圖示。                          19
圖2.10: 化學位移、脈衝、純量偶合之積運算子操作。           20
圖2.11：COSY之脈衝序列。                                20
圖2.12：TOCSY之脈衝序列。                               21
圖2.13：NOESY之脈衝序列。                               21
圖2.14: random coil中各胺基酸Hα化學位移範圍。             25
圖2.15: random coil中各胺基酸Cα、CO 、Cβ化學位移範圍。   25
圖3.1: 固相胜肽合成流程圖。                               37
圖3.2: Rink Amide AM Resin示意圖。                         38
圖3.3: 最左邊藍色區塊為N端Fmoc保護基。                 38
圖3.4: Pybop與HBTU結構圖。                              38
圖3.5: hNPY[21-31]在100%H2O中HPLC純化的光譜。	39
圖3.6: ESI+-Mass測得之hNPY[21-31]分子量。	40
圖4.1:hNPY[21-31]100%H2O到50%TFE之CD 疊圖。        54                        
圖4.2: hNPY[21-31] 60%TFE到100%TFE之CD 疊圖。	55
圖4.3:hNPY[21-31]之100%H2O與50%TFE 之CD 疊圖。      56
圖4.4: COSY 20個胺基酸自旋系統。	 57
圖4.5: hNPY[21-31] 100%水溶液Ala之TOCSY光譜判定。      58
圖4.6: hNPY[21-31] 100%水溶液Ser之TOCSY光譜判定。      59
圖4.7: hNPY[21-31] 100%水溶液Arg之TOCSY光譜判定。       60
圖4.8: hNPY[21-31] 100%水溶液Asn、His之光譜判定。        61
圖4.9: hNPY[21-31] 100%水溶液HSQC之His判定。           62
圖4.10:hNPY[21-31] 100%水溶Tyr之光譜判定。              63
圖4.11:hNPY[21-31] 100%水溶液HSQC之Tyr判定。  	 64
圖4.12: hNPY[21-31] 100%水溶液TOCSY之Ile判定。          65
圖4.13: hNPY[21-31] 100%水溶液TOCSY N H與其他質子訊號。 66
圖4.14: hNPY[21-31] 100%水溶液dαN(i,i+1)之NOE連結。       67
圖4.15: hNPY[21-31] 100%水溶液dβN(i,i+1)之NOE連結。	68
圖4.16: hNPY[21-31] 100%水溶液芳香環與質子間的NOE。       69
圖4.17: hNPY[21-31] 100%水溶液dβN(i,i+2)之NOE連結。	70
圖4.18: hNPY[21-31]100%水溶液dβN(i,i+3)之NOE連結。	71
圖4.19: hNPY[21-31]100%水溶液中所有NOE連結。             72
圖4.20: hNPY[21-31]100%水溶液TOCSY之NH和αH交叉峰。	73
圖4.21: hNPY[21-31]之[13C,1H]-HSQC光譜一。 	74
圖4.22: hNPY[21-31]在[13C,1H]-HSQC光譜二。                75
圖4.23: hNPY[21-31]在[13C,1H]-HSQC光譜三。  	76
圖4.24: hNPY[21-31]在[13C,1H]-HSQC光譜四。	77
圖4.25:hNPY[21-31] 50%TFE COSY之Ala光譜判定。          80
圖4.26:hNPY[21-31] 50%TFE COSY之Ser光譜判定。            81
圖4.27: hNPY[21-31] 50%TFE COSY之Arg光譜判定。	82
圖4.28: hNPY[21-31] 50%TFE COSY之Asn、His之光譜判定。    83
圖4.29: hNPY[21-31] 50%TFE HSQC之His判斷。              84
圖4.30: hNPY[21-31] 50%TFE Tyr之TOCSY光譜判定。         85  
圖4.31: hNPY[21-31] 50%TFE HSQC之Tyr判斷。   	86
圖4.32: hNPY[21-31] 50%TFE Ile與Leu之光譜判斷。	87
圖4.33: hNPY[21-31] 50%TFE COSY N H與其他質子訊號。	88
圖4.34: hNPY[21-31] 50%TFE dαN(i,i+1)之NOE連結。	89
圖4.35: hNPY[21-31] 50%TFE dβN(i,i+1)之NOE連結。	90
圖4.36: hNPY[21-31] 50%TFE dNN(i,i+1)之NOE連結。	91
圖4.37: hNPY[21-31] 50%TFE芳香環質子與其他質子間的NOE。 92
圖4.38: hNPY[21-31] 50%TFE dαN(i,i+2)之NOE連結。	93
圖4.39: hNPY[21-31] 50%TFE dαN(i,i+3)之NOE連結。	94
圖4.40: hNPY[21-31] 50%TFE dαN(i,i+4)之NOE連結。	95
圖4.41: hNPY[21-31] 50%TFE dβN(i,i+2)之NOE連結。	96
圖4.42: hNPY[21-31] 50%TFE dβN(i,i+3)之NOE連結。	97
圖4.43: hNPY[21-31] 50%TFE dβN(i,i+4)之NOE連結。	98
圖4.44: hNPY[21-31] 50%TFE dαβ(i,i+2)與dαβ(i,i+3)之NOE連結。 99
圖4.45: hNPY[21-31]在50%TFE，所有NOE連結。	101
圖4.46: hNPY[21-31]在50%TFE 所有NH-αH交叉峰。        102
圖4.47: hNPY[21-31]在50%TFE [13C,1H]-HSQC光譜之一。     103
圖4.48: hNPY[21-31]之50%TFE [13C,1H]-HSQC光譜之二。     104
圖4.49: hNPY[21-31]之50%TFE[13C,1H]-HSQC光譜之三。	105
圖4.50: hNPY[21-31]之 [13C,1H]-HSQC光譜之三。	106
圖5.1: hNPY[21-31]之CD各比例TFE變化圖。	114
圖5.2: hNPY[21-31]之100%水溶液αH Chemical Shift Index。	115
圖5.3: hNPY[21-31]之50%TFE αH Chemical Shift Index。	115
圖5.4: hNPY[21-31]之100%水溶液13αC Chemical Shift Index。   116
圖5.5: hNPY[21-31]之50%TFE 13αC Chemical Shift Index。	116
圖5.6: hNPY[21-31]之100%水溶液13βC Chemical Shift Index。   117
圖5.7: hNPY[21-31]之50%TFE 13βC Chemical Shift Index。	117
圖5.8: hNPY[21-31]之50%TFE與100%水αH CSI。	118
圖5.9: hNPY[21-31]之50%TFE與100%水  13αC CSI。	118
圖5.10: hNPY[21-31]之50%TFE與100%水13βC CSI。	119
圖5.11: hNPY[21-31]水溶液經由XPLOR計算結構。	119
圖5.12: hNPY[21-31] 50%TFE 之XPLOR計算結構。	120
圖5.13: hNPY[21-31] 50%TFE兩性螺旋之一。	121
圖5.14: hNPY[21-31] 50%TFE兩性螺旋之二。	121








表格索引
表2.1:積運算子之一些重要轉換。                             22
表3.1:最佳去保護時間及耦合時間。                          35
表3.2:合成hNPY[21-31]所需之藥品用量。                    35
表3.3: HPLC純化之梯度。                                  39
表4.1:h NPY[21-31]水溶液之1H化學位移。                    78
表4.2:h NPY[21-31]水溶液之13C化學位移。                   79
表4.3 h NPY[21-31]50%TFE溶液之1H化學位移。	107
表4.4 h NPY[21-31]50%TFE溶液之13C化學位移。	108
表5.1: hNPY[21-31]之CD各比例TFE溶液與二級結構含量表。 122
表5.2: hNPY[21-31]在50%TFE溶液下， helix之RMSD值。	122



 











              
 縮寫表
ACN                Acetonitrile
Ar                  Argon
aPP                 avian Pancreatic Polypeptide
bPP                 bovine Pancreatic Polypeptide
Boc                 tert-butyloxycarbony
CH2Cl2                      Dichloromethane
CD                 Circular dichroism
COSY              Correlation Spectroscopy
CSI                Chemical Shift Index
DMF               N,N-Dimethyl Formamdie
DCl                Deuterium Chloride
D2O                Deuterum Oxide
EtOH               Ethanol
EDT                1,2-ethanedithiol
Fmoc               9-fluorenylmethyloxycarbonyl
GPCRs             G-Protein couple Receptors
HCl                Hydrochloric acid
hNPY              Human Neuropeptide Y
hPP                human Pancreatic Polypeptide
HPLC              High performance liquid chromatography 
HOHAHA           Homonuclear Hartmann Hahn
HSQC              Heteronuclear Single Quantum Correlation
Nmm               4-Methylmorpholine
N2                           Nitrogen
NaOH              Sodium hydroxide
NaOD              Sodium Deuteroxide
NPY               Neuropeptide Y
NMR              Nuclear magnetic resonance
NOESY            Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy
NOE               Nuclear overhauser enhancement
PP                 Pancreatic Polypeptide
PYY               Peptide Tyrosine-tyrosine
pNPY              porcine Neuropeptide Y
RMSD             Root Mean Square Deviation
SPPS              Solid Phase Peptide Synthesis
TFA               Trifluoroacetic acid
TIS                Triethylsilane
TFE               Trifluoroethanol
TMS               Tetramethylsilane
TSP                Sodium-3-trimethylsilylpropionate
TOCSY             Total Correlation Spectroscopy
Y  Tyr              Tyrosin

六、	參考資料

1.	Bader, R.; Bettio, A.; Beck-Sickinger, A. G.; and Zerbe, O. “Structure and Dynamics of Micelle-bound Neuropeptide Y: Comparison with Unligated NPY and Implications for Receptors Selection.” J. Mol. Biol. 2001, 305, 307-329.
2.	McLean, L. R.; Buck, S. H.; Krstenansky, J. L. “Examination of the Role of the Amphiphatic α-Helix in the Interaction of Neuropeptide Y and Active Cylic Analogues with Cell Membrane Receptors and dimyristolphosphatidylcholine” Biochemisry, 1990, 29, 2016-2022.
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