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系統識別號 U0002-1802200802003400
中文論文名稱 利用CD和NMR研究合成的神經胜肽片段hNPY【21-31】之結構
英文論文名稱 Conformational studies of synthesized neuropeptide fragment hNPY[21-31] by CD and NMR.
校院名稱 淡江大學
系所名稱(中) 化學學系碩士班
系所名稱(英) Department of Chemistry
學年度 96
學期 1
出版年 97
研究生中文姓名 林嘉豪
研究生英文姓名 Chia-Hao Lin
學號 694170597
學位類別 碩士
語文別 中文
口試日期 2008-01-17
論文頁數 126頁
口試委員 指導教授-李長欣
委員-陳佩燁
委員-陳銘凱
中文關鍵字 二維核磁共振  圓二色光譜儀  神經胜肽  固相胜肽合成法 
英文關鍵字 2D NMR  CD  NPY  PP  SPPS 
學科別分類 學科別自然科學化學
中文摘要 人類神經胜肽Y(Human Neuropeptide Y, hNPY)在水溶液中具有α-螺旋結構,且低濃度下結構為單體,高濃度時則為雙體。其結構有特定作用機制:單體下先與膜微脂粒(membrane micelle)結合後進一步與GPCRs(G protein-coupled receptors)作用。
固相胜肽合成法(Solid Phase Peptide Synthesis)合成hNPY片段序列(hNPY[21-31]),經由高效能液相層析儀純化,質譜儀確認分子量,再用圓二色光譜(Circular Dichroism)觀察不同比例TFE溶液下,二級結構的變化,選擇100%水溶液與50%TFE兩溶液做結構測量與討論。用二維核磁共振(two-dimensional NMR)的光譜: COSY、TOCSY、ROESY、NOESY、[1H, 13C]-HSQC及光譜判定(Assignment)和光譜循序判定(Sequential assignment),各別判定兩溶液之11個殘基質子與13碳的化學位移。經由NOE限制條件分別計算兩溶液之3D結構,100%水溶液呈現鬆散不規則結構,50%TFE溶液則在24Leu~28Asn出現α-螺旋結構。
配合CD、CSI(Chemical Shift Index)、NMR、結構計算,討論兩比例溶液之結構差異,並與NPY結構比較。

英文摘要 Human Neuropeptide Y(hNPY) has a well-defined α-helical structure in solution, and is monomer at low concentration, dimer at high concentration. It has specific binding mechanism: First, the monomer structure binds with membrane micelle, and further interacts with G protein-coulpled receptors(GPCRs).
We synthesize neuropeptide fragment hNPY[21-31] by solid phase peptide synthesis, purified by RP-HPLC and made sure the molecular weight by Mass. The conformation and dynamics of hNPY[21-31] in difference solvent condition is studied by CD and 2D NMR experiment.
2D NMR experiments of COSY, TOCSY, ROESY, NOESY, and [1H, 13C]-HSQC were acquired. With NOE restrained structural calculation, the major structure of hNPY[21-31] in 100% H2O is random coil and form regular α-helical structure between 24Leu and 28Asn in 50%TFE/50% H2O.
Combination of CD, NMR, and XPLOR molecular calculation, we can investigate the conformational difference between 100%H2O and 50%TFE /50%H2O, and compare with native NPY.
論文目次 目錄

一、緒論 1
1.1 NPY家族 1
1.2 NPY在水溶液與膜微脂粒中結構變化 2
1.3 研究目的 3

二、原理 6
2.1固相胜肽合成法 6
2.2-1圓二色光譜儀測量 10
2.2-2 蛋白質或多胜肽之圓二色光譜 13
2.3 二維核磁共振原理 15
2.3-1 COSY光譜 16
2.3-2 TOCSY光譜 17
2.3-3 NOESY實驗 17
2.4化學位移指數 23

三、實驗之材料與方法 26
3.1材料 26
3.2方法 32

四、結果 45

五、討論 109

六、參考資料 123






























圖片索引
圖1.1: NPY家族序列與結構圖示。 4
圖1.2: 左為bPP,右為pNPY之水溶液三級結構圖。 4
圖1.3:pNPY水溶液之兩種雙體結構。 4
圖1.4: pNPY單體與micelle結合後之17個結構計算疊圖。 5
圖1.5: pNPY與micelle結合流程圖。 5
圖2.1 :固相胜肽合成法示意圖。 8
圖2.2: 去除保護基之流程圖。 9
圖2.3: Ninhydrin Test反應機制。 9
圖2.4: 光之振動電場(E)與磁場(M)示意圖。 12
圖2.5: 光通過平面極化器(polarized)之示意圖。 12
圖2.6: 左、右旋圓偏極光之合成圖。 13
圖2.7:蛋白質之各種二級結構在圓二色光譜儀上的吸收圖。 14
圖2.8: 二維核磁共振實驗脈衝序列之四個時期。 19
圖2.9: 演化期之t1 值線性增加圖示。 19
圖2.10: 化學位移、脈衝、純量偶合之積運算子操作。 20
圖2.11:COSY之脈衝序列。 20
圖2.12:TOCSY之脈衝序列。 21
圖2.13:NOESY之脈衝序列。 21
圖2.14: random coil中各胺基酸Hα化學位移範圍。 25
圖2.15: random coil中各胺基酸Cα、CO 、Cβ化學位移範圍。 25
圖3.1: 固相胜肽合成流程圖。 37
圖3.2: Rink Amide AM Resin示意圖。 38
圖3.3: 最左邊藍色區塊為N端Fmoc保護基。 38
圖3.4: Pybop與HBTU結構圖。 38
圖3.5: hNPY[21-31]在100%H2O中HPLC純化的光譜。 39
圖3.6: ESI+-Mass測得之hNPY[21-31]分子量。 40
圖4.1:hNPY[21-31]100%H2O到50%TFE之CD 疊圖。 54
圖4.2: hNPY[21-31] 60%TFE到100%TFE之CD 疊圖。 55
圖4.3:hNPY[21-31]之100%H2O與50%TFE 之CD 疊圖。 56
圖4.4: COSY 20個胺基酸自旋系統。 57
圖4.5: hNPY[21-31] 100%水溶液Ala之TOCSY光譜判定。 58
圖4.6: hNPY[21-31] 100%水溶液Ser之TOCSY光譜判定。 59
圖4.7: hNPY[21-31] 100%水溶液Arg之TOCSY光譜判定。 60
圖4.8: hNPY[21-31] 100%水溶液Asn、His之光譜判定。 61
圖4.9: hNPY[21-31] 100%水溶液HSQC之His判定。 62
圖4.10:hNPY[21-31] 100%水溶Tyr之光譜判定。 63
圖4.11:hNPY[21-31] 100%水溶液HSQC之Tyr判定。 64
圖4.12: hNPY[21-31] 100%水溶液TOCSY之Ile判定。 65
圖4.13: hNPY[21-31] 100%水溶液TOCSY N H與其他質子訊號。 66
圖4.14: hNPY[21-31] 100%水溶液dαN(i,i+1)之NOE連結。 67
圖4.15: hNPY[21-31] 100%水溶液dβN(i,i+1)之NOE連結。 68
圖4.16: hNPY[21-31] 100%水溶液芳香環與質子間的NOE。 69
圖4.17: hNPY[21-31] 100%水溶液dβN(i,i+2)之NOE連結。 70
圖4.18: hNPY[21-31]100%水溶液dβN(i,i+3)之NOE連結。 71
圖4.19: hNPY[21-31]100%水溶液中所有NOE連結。 72
圖4.20: hNPY[21-31]100%水溶液TOCSY之NH和αH交叉峰。 73
圖4.21: hNPY[21-31]之[13C,1H]-HSQC光譜一。 74
圖4.22: hNPY[21-31]在[13C,1H]-HSQC光譜二。 75
圖4.23: hNPY[21-31]在[13C,1H]-HSQC光譜三。 76
圖4.24: hNPY[21-31]在[13C,1H]-HSQC光譜四。 77
圖4.25:hNPY[21-31] 50%TFE COSY之Ala光譜判定。 80
圖4.26:hNPY[21-31] 50%TFE COSY之Ser光譜判定。 81
圖4.27: hNPY[21-31] 50%TFE COSY之Arg光譜判定。 82
圖4.28: hNPY[21-31] 50%TFE COSY之Asn、His之光譜判定。 83
圖4.29: hNPY[21-31] 50%TFE HSQC之His判斷。 84
圖4.30: hNPY[21-31] 50%TFE Tyr之TOCSY光譜判定。 85
圖4.31: hNPY[21-31] 50%TFE HSQC之Tyr判斷。 86
圖4.32: hNPY[21-31] 50%TFE Ile與Leu之光譜判斷。 87
圖4.33: hNPY[21-31] 50%TFE COSY N H與其他質子訊號。 88
圖4.34: hNPY[21-31] 50%TFE dαN(i,i+1)之NOE連結。 89
圖4.35: hNPY[21-31] 50%TFE dβN(i,i+1)之NOE連結。 90
圖4.36: hNPY[21-31] 50%TFE dNN(i,i+1)之NOE連結。 91
圖4.37: hNPY[21-31] 50%TFE芳香環質子與其他質子間的NOE。 92
圖4.38: hNPY[21-31] 50%TFE dαN(i,i+2)之NOE連結。 93
圖4.39: hNPY[21-31] 50%TFE dαN(i,i+3)之NOE連結。 94
圖4.40: hNPY[21-31] 50%TFE dαN(i,i+4)之NOE連結。 95
圖4.41: hNPY[21-31] 50%TFE dβN(i,i+2)之NOE連結。 96
圖4.42: hNPY[21-31] 50%TFE dβN(i,i+3)之NOE連結。 97
圖4.43: hNPY[21-31] 50%TFE dβN(i,i+4)之NOE連結。 98
圖4.44: hNPY[21-31] 50%TFE dαβ(i,i+2)與dαβ(i,i+3)之NOE連結。 99
圖4.45: hNPY[21-31]在50%TFE,所有NOE連結。 101
圖4.46: hNPY[21-31]在50%TFE 所有NH-αH交叉峰。 102
圖4.47: hNPY[21-31]在50%TFE [13C,1H]-HSQC光譜之一。 103
圖4.48: hNPY[21-31]之50%TFE [13C,1H]-HSQC光譜之二。 104
圖4.49: hNPY[21-31]之50%TFE[13C,1H]-HSQC光譜之三。 105
圖4.50: hNPY[21-31]之 [13C,1H]-HSQC光譜之三。 106
圖5.1: hNPY[21-31]之CD各比例TFE變化圖。 114
圖5.2: hNPY[21-31]之100%水溶液αH Chemical Shift Index。 115
圖5.3: hNPY[21-31]之50%TFE αH Chemical Shift Index。 115
圖5.4: hNPY[21-31]之100%水溶液13αC Chemical Shift Index。 116
圖5.5: hNPY[21-31]之50%TFE 13αC Chemical Shift Index。 116
圖5.6: hNPY[21-31]之100%水溶液13βC Chemical Shift Index。 117
圖5.7: hNPY[21-31]之50%TFE 13βC Chemical Shift Index。 117
圖5.8: hNPY[21-31]之50%TFE與100%水αH CSI。 118
圖5.9: hNPY[21-31]之50%TFE與100%水 13αC CSI。 118
圖5.10: hNPY[21-31]之50%TFE與100%水13βC CSI。 119
圖5.11: hNPY[21-31]水溶液經由XPLOR計算結構。 119
圖5.12: hNPY[21-31] 50%TFE 之XPLOR計算結構。 120
圖5.13: hNPY[21-31] 50%TFE兩性螺旋之一。 121
圖5.14: hNPY[21-31] 50%TFE兩性螺旋之二。 121








表格索引
表2.1:積運算子之一些重要轉換。 22
表3.1:最佳去保護時間及耦合時間。 35
表3.2:合成hNPY[21-31]所需之藥品用量。 35
表3.3: HPLC純化之梯度。 39
表4.1:h NPY[21-31]水溶液之1H化學位移。 78
表4.2:h NPY[21-31]水溶液之13C化學位移。 79
表4.3 h NPY[21-31]50%TFE溶液之1H化學位移。 107
表4.4 h NPY[21-31]50%TFE溶液之13C化學位移。 108
表5.1: hNPY[21-31]之CD各比例TFE溶液與二級結構含量表。 122
表5.2: hNPY[21-31]在50%TFE溶液下, helix之RMSD值。 122
















縮寫表
ACN Acetonitrile
Ar Argon
aPP avian Pancreatic Polypeptide
bPP bovine Pancreatic Polypeptide
Boc tert-butyloxycarbony
CH2Cl2 Dichloromethane
CD Circular dichroism
COSY Correlation Spectroscopy
CSI Chemical Shift Index
DMF N,N-Dimethyl Formamdie
DCl Deuterium Chloride
D2O Deuterum Oxide
EtOH Ethanol
EDT 1,2-ethanedithiol
Fmoc 9-fluorenylmethyloxycarbonyl
GPCRs G-Protein couple Receptors
HCl Hydrochloric acid
hNPY Human Neuropeptide Y
hPP human Pancreatic Polypeptide
HPLC High performance liquid chromatography
HOHAHA Homonuclear Hartmann Hahn
HSQC Heteronuclear Single Quantum Correlation
Nmm 4-Methylmorpholine
N2 Nitrogen
NaOH Sodium hydroxide
NaOD Sodium Deuteroxide
NPY Neuropeptide Y
NMR Nuclear magnetic resonance
NOESY Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy
NOE Nuclear overhauser enhancement
PP Pancreatic Polypeptide
PYY Peptide Tyrosine-tyrosine
pNPY porcine Neuropeptide Y
RMSD Root Mean Square Deviation
SPPS Solid Phase Peptide Synthesis
TFA Trifluoroacetic acid
TIS Triethylsilane
TFE Trifluoroethanol
TMS Tetramethylsilane
TSP Sodium-3-trimethylsilylpropionate
TOCSY Total Correlation Spectroscopy
Y Tyr Tyrosin


參考文獻 六、 參考資料

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