Human Pancreatic Polypeptide（hPP）隸屬於NPY家族（Neuropeptide Y Family）。包含幾項特徵：有36個胺基酸殘基；C端以NH2來做結束（C-terminally amidated）；且具有PP-fold。hPP與Y4或是Y5 Receptor結合後，在中樞神經系統中扮演著促進食物的攝取以及提醒胃空了。結構上，C端為α-helical部分而N端有polyproline helix，polyproline helix會彎曲回來與α-helical相連接，形成特有的PP-fold.結構。hPP在水溶液中以dimer的方式存在，當它與micelle作用時，便形成monomer。Monomer結構對作用中的hPP而言更顯得重要。透過短片段序列減少dimer的發生機會，並研究短片段狀況下是否依然具有規則結構。
我們研究hPP【17-24】序列，位於hPP α-helical部分。利用SPPS來合成hPP【17-24】，透過HPLC分離及純化並送測Mass鑑定分子量。最後利用CD及2D NMR實驗來研究hPP【17-24】在100%H2O與50%TFE / 50%H2O溶液下的結構。結果發現hPP【17-24】在兩種溶液中均喪失α-helical結構。hPP【17-24】在100%H2O中以Random coil形式存在；在50%TFE / 50%H2O溶液下逐漸有規則結構形成。

The human pancreatic polypeptide(hPP), a 36-residue, polypeptide hormone is a member of the neuropeptide Y(NPY)family. In the central nervous system PP promotes food intake and gastric emptying by activation of the Y4 and probably Y5 receptors. The C-terminal is a well-defined α-helical region and the N terminus is an extended polyproline helix which bent back onto the the C-terminalα-helix. The structural motif of pp has been named as the PP-fold. hPP in solution exists as a dimer and when bound to micelle, it exists as a monomer. Therefore, to elucidate the monomer structure is important. Short peptide fragment may avoid dimmer formation and reveal the folding dynamoics of hpp.
 We studied hPP[17-24] ,of α-helical region, and used SPPS method for synthesizing the residues17-24.Isolation and purification were performed by HPLC and the molecular weight were made sure by Mass. The conformation and dynamics of hPP[17-24] in different solvent condition is studied by CD and 2D NMR experiment. Conformation of hPP[17-24] exists as a random coil in 100%H2O and become more regular in 50%TFE / 50%H2O of hPP[17-24].

目錄
第一章	 序論                                               1
1.1  NPY家族                                       2
      1.2  PP介紹                                         6
      1.3  結構變化                                      11
      1.4  研究目的                                      12
第二章	 文獻回顧                                          14
2.1  結構重要性                                    14
2.2  2D NMR原理                                  23
2.3  CD原理                                       38
2.4  SPPS原理                                     46
第三章	 實驗材料與方法  
3.1  實驗材料                                      56
3.2  實驗方法                                      63
第四章	 結果                                              77
第五章	 討論                                             141
第六章	 未來研究                                         152
參考文獻                            153



圖片索引
圖1-1  NPY Family之結構與序列。                            3
圖1-2  豬之PYY、NPY與牛的PP在水溶液中單體結構圖。      3
圖1-3  aPP之晶體結構。                                    8 
圖1-4  以NPY序列形成PP-fold。                            9
圖1-5  PP與NPY之雙體形式                               10
圖1-6  hPP結構變化。                                     13
圖2-1  胺基酸基本結構。                                  16
圖2-2  二十種胺基酸分類                                  16
圖2-3  兩胺基酸脫一分子水形成胜肽鍵。                    18
圖2-4  多肽鍵的構成。                                    18
圖2-5  蛋白質一級結構－胺基酸殘基序列。                  20
圖2-6  蛋白質二級結構－a-helix。                          20
圖2-7  蛋白質二級結構－b-sheet。                          21
圖2-8  蛋白質二級結構－b-turn。                           21
圖2-9  蛋白質靠非共價鍵的力量來穩定其三級結構。          22
圖2-10  蛋白質的四種結構關係圖。                         22
圖 2-11  各維度脈衝序列。                                 31
圖2-12  二維核磁共振實驗之脈衝序列可分四個時期。         31
圖2-13  脈衝對磁化量的變化。                             32
圖2-14  將t1 線性的增加實驗。                             32
圖2-15  傅利葉轉換。                                     33
圖2-16  COSY脈衝序列。                                  34
圖2-17  TOCSY脈衝序列。                                34
圖2-18  二自旋系統的弛緩。                               35
圖2-19  NOESY脈衝序列。                                35
圖 2-20  六個殘基經由NOE數據所計算而得的結構。           36
圖2-21  HSQC脈衝序列。                                  36
圖2-22  光之電場與磁場示意圖。                           39
圖2-23  光通過平面極化器後產生單一線性光源。             39
圖2-24  光通過旋光性物質後會產生相角。                   40
圖2-25  光通過旋光物質。                                 40
圖2-26  四種結構的CD吸收圖形。                         45
圖2-27  α-helix、β-sheet、random coil、PPⅡ的CD吸收圖形 45
圖2-28  樹脂透過連接劑與胺基酸序列相連接。               46
圖2-29  SPPS簡易過程示意圖。                            48
圖2-30  高分子聚合物樹脂。                               51
圖2-31  羧基和胺基相互連接形成醯胺。                     51
圖2-32  在鹼性條件下除去胺端保護基Fmoc。                51
圖2-33  在酸性條件下除去胺端保護基BOC。                 51
圖2-34  Fmoc為胺端保護基的胺基酸。                      53
圖2-35  SPPS合成步驟流程圖。                            53
圖2-36  Ninhydrin Test之反應式。                           圖2-37  Ninhydrin反應後所呈現的顏色。                     54
圖3-1  Rink Amide AM Resin切除後會保有NH2。             67
圖3-2  Rink Amide AM Resin分子式。                       67
圖3-3  N端保護基及側鏈保護基。                          67
圖3-4  TFA亦能將側鏈保護基去除。                        67
圖3-5  合成胜肽流程圖。                                  68
圖3-6  透過PyBop促進每一個胺基酸形成胜肽鍵。            69
圖3-7  降低消旋作用耦合試劑。                            69
圖3-8  胺基酸具有Fmoc避免消旋作用發生。                 69
圖3-9  切除試劑的選擇。                                  70
圖3-10  利用胜肽合成儀PS3之胜肽合成過程。               71
圖3-11  HPLC純化之Main Peak。                           72
圖3-12  ESI+-Mass圖。                                    73
圖4-1  hpp【17-24】40%TFE以下CD吸收值。                 84
圖4-2  50％TFE~100%TFE中CD吸收值。                   85
圖4-3  比較100％H2O及 50％TFECD的吸收值。             86
圖4-4  COSY之20個胺基酸Spin System。                   87
圖4-5  TOCSY之20個胺基酸Spin System。                  88
圖4-6  hPP【17-24】在90％H2O / 10％D2O中的COSY圖。     89
圖4-7  hPP【17-24】Leu在COSY光譜的Assignment。        90
圖4-8a  hPP【17-24】Ala在COSY光譜的Assignment。        91
圖4-8b  hPP【17-24】Ala在TOCSY光譜的Assignment。       92
圖4-9  hPP【17-24】Tyr在COSY光譜的Assignment。         93
圖4-10a  hPP【17-24】Tyr在TOCSY光譜的Assignment。      94
圖4-10b  hPP【17-24】Asp在TOCSY光譜的Assignment。     95
圖4-11  hPP【17-24】Met在COSY光譜的Assignment。       96
圖4-12  hPP【17-24】Gln在COSY光譜的Assignment。        97
圖4-13  hPP【17-24】Tyr與Gln側鏈之COSY圖。            98
圖4-14  循序判定法。                                      99
圖4-15  hPP【17-24】 ROESY圖Sequential的daN。          100
圖4-16  hPP【17-24】ROESY圖Sequential的dbN。          101
圖4-17  hPP【17-24】Ala18 NH~Tyr20NH的ROESY圖。      102
圖4-18  hPP【17-24】Tyr20NH與Aromatic的ROESY圖。    103
圖4-19  hPP【17-24】Ala21 NH~Leu24 NH的ROESY圖。     104
圖4-20  hPP【17-24】Tyr20 Aromatic的ROESY圖。          105
圖4-21  hPP【17-24】在90％H2O / 10％D2O中HSQC圖。    106
圖4-22  hPP【17-24】1H化學位移2ppm以下HSQC光譜。    107
圖4-23  hPP【17-24】1H化學位移3ppm以下HSQC光譜。    108
圖4-24  hPP【17-24】aH位置HSQC光譜。                 109
圖4-25  hPP【17-24】Aromatic 1H化學位移HSQC光譜。      110
圖4-26  hPP【17-24】在50％H2O / 50％TFE中之COSY圖。   111
圖4-27  hPP【17-24】Leu在COSY光譜的Assignment。       112
圖4-28  hPP【17-24】Ala在COSY光譜的Assignment。       113
圖4-29  hPP【17-24】Tyr在COSY光譜的Assignment。       114
圖4-30  hPP【17-24】Asp在COSY光譜的Assignment。       115
圖4-31  hPP【17-24】Met在COSY光譜的Assignment。       116
圖4-32  hPP【17-24】Gln在COSY光譜的Assignment。       117
圖4-33  hPP【17-24】Tyr與Gln側鏈之COSY圖。           118
圖4-34  hPP【17-24】NOESY圖Sequential的daN。           119
圖4-35：hPP【17-24】NOESY圖Sequential的daN。           120
圖4-36  hPP【17-24】NOESY圖Sequential的dbN。          121
圖4-37  hPP【17-24】NOESY圖Sequential的dbN。          122
圖4-38  hPP【17-24】Ala18 NH~Tyr20 NH的NOESY圖。     123
圖4-39  hPP【17-24】Ala21 NH~Ala22 NH的NOESY圖。    124
圖4-40  hPP【17-24】Asp23 NH~Leu24 NH的NOESY圖。    125
圖4-41  hPP【17-24】Tyr20 Aromatic的NOESY圖。          126
圖4-42  hPP【17-24】Tyr20 aH的NOESY圖。              127
圖4-43  hPP【17-24】在50％H2O / 50％TFE中HSQC圖。     128
圖4-44  hPP【17-24】1H化學位移2ppm左右HSQC光譜。    129
圖4-45  hPP【17-24】1H化學位移3ppm附近HSQC光譜。    130
圖4-46  hPP【17-24】aH位置HSQC光譜圖。               131
圖4-47  hPP【17-24】Aromatic 1H化學位移HSQC光譜。      132
圖5-1  hPP【15-29】在不同比例TFE下之CD光譜圖。       145
圖5-2  hPP【15-29】在100％H2O與30％TFE CD光譜比較圖。  146
圖5-3  hPP【17-24】與hPP【15-29】CD光譜比較圖。        147
圖5-4  hPP【17-24】在aH、aC與bC之CSI。               148
圖5-5  hPP【17-24】模擬計算結構。                        149
圖5-6  hPP【17-24】16個NOE之30個結構堆疊。           150
圖5-7：hPP【17-24】19個NOE之30個結構堆疊。           151




表格索引
表1-1  NPY家族與Y Receptors結合程度與生理作用。          5
表2-1  無序列纏繞下各殘基平均化學位移。                  37
表3-1  去保護基與偶合反應時間。                          65
表3-2  藥品名稱對照分子量。                              65
表3-3  hPP【17-24】分析時所使用的梯度。                  72
表3-4  CD儀器操作所有設定之參數。                       74
表4-1  20個胺基酸在無序纏捲時各氫的平均化學位移。        133
表4-2  20個胺基酸之aH與aC、bC之標準化學位移。        134
表4-3  hPP【17-24】在90％H2O / 10％D2O中1H化學位移。   135
表4-4  hPP【17-24】在90％H2O / 10％D2O中13C化學位移。   136
表4-5  hPP【17-24】在90％H2O / 10％D2O中的NOE。       137
表4-6  hPP【17-24】在50％H2O / 50％TFE中1H化學位移。   138
表4-7  hPP【17-24】在50％H2O / 50％TFE中13C化學位移。   139
表4-8  hPP【17-24】在50％H2O / 50％TFE中的NOE。       140

參考資料
<1>Colmers WF, Bleakman D (1994) Effects of neuropeptide Y on  
     the electrical properties of neurons. Trends Neurosci, 17, 73–379.

<2> Michel M. C., Beck-Sickinger A. G., Cox, H., Doods H. N., 
    Herzog H., Larhammar D. et al. (1998). XVI International Union   
    of Pharmacology recommendations for the nomenclature of   
    neuropeptide Y,peptide YY, and pancreatic polypeptide receptors.
    Pharmacol. Rev, 50, 143–150.

<3> Turton M.D., O’Shea, D., Bloom, S.R. (1997). Central effects of 
   neuropeptide Y with emphasis on its role in obesity and diabetes. In 
   Neuropeptide Y and drug development, (eds. L. Grundemar and S.R. 
   Bloom ), pp. 15–39, Academic Press, San Diego.

<4> Reto B., Andrea B., Annette G. B., Oliver Z., (2001). Structure and 
    Dynamics of Micelle-bound Neuropeptide Y:Comparison with 
    Unligated NPY and Implications for Receptor Selection. J.Mol.Biol, 
    305,307-329

<5> Rea B., Michaela C. D., Annette G. B., (2002) The neuropeptide Y 
    monomer in solution is not folded in the pancreatic-polypeptide fold. 
    Protein Science, 11, 1834–1844.

<6> Mirjam L., Hiroshi K., Gerd F., Marie-Isabel A., Annette G. B., 
    Oliver Z. (2005) Strongly Altered Receptor Binding Properties in PP 
    and NPY Chimeras Are Accompanied by Changes in Structure and 
    Membrane Binding. Biochemistry, 44 9255-9264

<7> Mirjam L., Margot M., Oliver Z.. (2004) Structural Similarities of 
    Micelle-bound Peptide YY (PYY) and Neuropeptide Y (NPY) are 
    Related to their Affinity Profiles at the Y Receptors. J. Mol. Biol, 
    339, 1153–1168




<8> Jan M. L., Lars T., Tomas H., Kazuhiko T., (1984) Comparative 
    immunohistochemical and biochemical analysis of pancreatic 
    polypeptide-like with special reference to presence of neuropeptide 
    Y in central and peripheral neurons. The Journal of Neuroscience, 4, 
    2376-2386

<9> Herve D., Jean-Marie B., Colette D., Jacques C., Alain R., 
    Christian C., (1992) Solution conformation of human neuropeptide 
    Y by 1H nuclear magnetic resonance and restrained molecular  
    dynamics. Eur,J.Biochem,. 209, 765-771

<10> Andrea B., Annette G. B., (2001) Biophysical Methods to Studyig 
    and–Receptor Interactions of Neuropeptide Y. Biopolymers (Peptide 
    Science), 60, 420–437 

<11> Mirjam L., Verena G., Reto B., Barbara C., Gerd F., Oliver Z., 
    (2002) Bovine Pancreatic Polypeptide (bPP) Undergoes Significant 
    Changes in Conformation and Dynamics upon Binding to DPC 
    Micelles. J. Mol. Biol, 322, 1117-1133.

<12> Blundell T. L., Pitts J. E., Tickle I. J., Wood S. P.Wu, C.-W. 
    (1981). X-ray analysis (1.4A ° resolution) of avian pancreatic  
    polypeptide: small globular protein hormone. Proc. Natl Acad. Sci. 
    USA, 78, 4175–4179.

<13> Li X. A., Sutcliffe M. J., Schwartz T. W., Dobson C. M., (1992)
     Sequence-specific 1H NMR assignments and solution structure of 
     bovine pancreatic polypeptide. Biochemistry, 31, 1245–1253.

<14> Chin J. W., Grotzfeld R. M., Fabian M. A., Schepartz A. (2001). 
    . Methodology for optimizing functional miniature proteins based on  
     avian pancreatic polypeptide using phage display. Bioorg Med. 
     Chem. Letters, 11, 1501–1505

<15> Zondlo N. J., Schepartz, A. (1999). Highly specific DNA  
     recognition by a designed miniature protein. J. Am. Chem. Soc,  
     121, 6938–6939

<16> Dan Larhammar. (1996) Evolution of neuropeptide Y, peptide  
     YY and pancreatic polypeptide. Regulatory Peptides, 62, 1-11

<17> Chin J. W., Schepartz A. (2001). Concerted evolution of  
     structure and function in a miniature protein. J. Am. Chem. Soc, 
     123, 2929–2930.

<18> Nai-Wei Kuo, Sunney I. Chan. (2004) Effects of turn mutation on 
     the structure,stability and folding kinetics of a beta-sheet peptide.   
     國立清華大學化學研究所碩士論文

<19> Leninger. (2005) Principle of Biochemistry 4thedition.

<20>藝軒圖書出版社, 生物化學 Outline of Biochemistry.

<21>P. J. Hore, J. A. Jones, S. Wimperis. (2000) NMR: The Toolkit.

<22> 余靖, 李長欣. 核磁共振專輯(二), (1998) 國科會精密儀器發展
     中心.

.<23> 丁尚武,黃麗純. (2003) Structure and Dynamics of a Novel Cobra   
     Cardiotoxin CTXn as Derived from Nuclear Magnetic Resonance 
     Spectroscopy. 國立中山大學化學研究所碩士論文

<24> 錢偉鈞, 陳亦徵. (2003) The orientation and dynamics of 
     somatostatin in lipid environment. 朝陽科技大學映月化學所碩
     士論文


<25> 丁尚武, 方菁霞. (2004) The Dynamics of Protein CTXn from
      NMR Relaxation Studies.國立中山大學化學系研究所碩士論文

<26> D. S. Wishart, B. D. Sykes, F. M. Richards. (1992) The Chemical  
     Shift Index: A Fast and Simple Method for the Assignment of 
     Protein Secondary Structure through NMR Spectroscopy.  
     Biochemistry, 31, 1647-1651

<27> David S. Wishart, Brian D. Sykes. (1992) The 13C Chemical-Shift 
     Index: A simple method for the identification of protein secondary 
     structure using 13C chemical-shift data. Biochemistry, 31, 647-1651

<28> Nina B., Koji N., Robert W. Woody. Circular cichroism principle 
     and Applications. Second Edition.

<29> 錢偉鈞, 簡偉任. (2004) The role of lysine residues in 
     Somatostatin. 朝陽科技大學應用化學系碩士論文

<30> 吳旻珈, 陳文逸. (2004) Studies of Protein Conformation at 
      Solid/Liquid and Air/Liquid Interfaces by Surface Plasmon 
      Resonance and Langmuir-Blodgett Trough. 國立中央大學化學 
      工程與材料工程研究所碩士論文

<31> Arianna R., Alan R. D., Charles M. D., (2005) The Structure of 
     “Unstructured” Regions in Peptides and Proteins: Role of the 
     Polyproline II Helix in Protein Folding and Recognition.
     Biopolymers (Peptide Science), 80, 179–185

<32> Fmoc solid phase peptide synthesis Edited by Weng C. Chan and 
     Peter D. White.

<33> Giuseppina S., Mario C., Alberto B., Anna M., Papini. (2004) 
     Analytical Methods for Solid Phase Peptide Synthesis. Current 
     Organic Chemistry, 8, 291-301

<34> Merck Biosciences. Novabiochem 2004/5 Catalog.

<35>Sundler F., Bo&uml;ttcher G., Ekblad E., Hakanson R., (1993) PP, PYY, 
    and NPY : Occurrence and distribution in the periphery, in The 
    Biology of Neuropeptide Y and Related Peptides (Colmers WF and 
    Wahlestedt C, eds) pp 157–196, Humana Press, Totowa, NJ.

<36>Lundberg J. M., (1996) Pharmacology of cotransmission in the 
    autonomic nervous system: Integrative aspects on amines, 
    neuropeptides, adenosine triphosphate , amino acids and nitric oxide. 
    Pharmacol Rev, 48, 113–178.

<37>Wang Z-L., Bennet W. M., Wang R-M., Ghatei M. A., Bloom S. R.,
    (1994) Evidence of a paracrine role of neuropeptide-Y in the 
    regulation of insulin release from pancreatic islets of normal and 
    dexamethasone-treated rats. Endocrinology, 135, 200–206.

<38>Larhammar D., (1996a) Evolution of neuropeptide Y, peptide YY 
    and pancreatic polypeptide. Regul Pept, 62, 1–11.

<39>Tatemoto K., Carlquist, M., Mutt, V. (1982). Neuropeptide Y – a 
    novel brain peptide with structural similarities to peptide YY and 
    pancreatic polypeptide. Nature, 296, 659-660.

<40> Grundemar L., 1997. Multiple receptors and multiple actions. In 
   Neuropeptide Y and drug development, (eds. L. Grundemar and S.R. 
   Bloom), pp. 1–14. Academic Press, New York.

<41> Allen J., Novotny J., Martin J., and Heinrich G., (1987). Molecular 
     structure of mammalian neuropeptide Y: Analysis by molecular 
     cloning and computeraided comparison with crystal structure of 
     avian homologue. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 2532–2536.


<42>Clark J. T., Kalra P. S., Crowley W. R., Kalra, S. P., (1984).   
     Neuropeptide Y and human pancreatic polypeptide stimulate   
     feeding behavior in rats. Endocrinology, 115, 427–429.

<43> Inui A., Okita M., Nakajima M., Inoue T., Sakatani N., Oya M.,
     et al. (1991). Neuropeptide regulation of feeding in dogs. Am. J. 
    Physiol, 261, R588–R594.

<44>錢偉鈞, 徐建斌. (2003) The conformational study of a peptide 
    pheromone-sodefrin. 朝陽科技大學映月化學所碩士論文

<45>張家靖, 鄭嘉良, 周輔宣. (2006) Thermoldynamic analysis of 
    self-organized bio-macromolecule : the reaction paths analysis of 
    protein folding and denaturation.國立東華大學應用物理研究所碩
    士論文