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系統識別號 U0002-1702200805192700
中文論文名稱 利用CD和NMR研究合成的神經胜肽片段hPP【17-24】之結構
英文論文名稱 Conformational studies of synthesized neuropeptide fragment hPP【17-24】by CD and NMR
校院名稱 淡江大學
系所名稱(中) 化學學系碩士班
系所名稱(英) Department of Chemistry
學年度 96
學期 1
出版年 97
研究生中文姓名 吳明儒
研究生英文姓名 Ming-Ju Wu
學號 694170555
學位類別 碩士
語文別 中文
口試日期 2008-01-17
論文頁數 158頁
口試委員 指導教授-李長欣
委員-陳佩燁
委員-陳銘凱
中文關鍵字 核磁共振  圓二色光譜儀  神經胜肽  固相胜肽合成法 
英文關鍵字 2D NMR  CD  NPY  PP  SPPS. 
學科別分類 學科別自然科學化學
中文摘要 Human Pancreatic Polypeptide(hPP)隸屬於NPY家族(Neuropeptide Y Family)。包含幾項特徵:有36個胺基酸殘基;C端以NH2來做結束(C-terminally amidated);且具有PP-fold。hPP與Y4或是Y5 Receptor結合後,在中樞神經系統中扮演著促進食物的攝取以及提醒胃空了。結構上,C端為α-helical部分而N端有polyproline helix,polyproline helix會彎曲回來與α-helical相連接,形成特有的PP-fold.結構。hPP在水溶液中以dimer的方式存在,當它與micelle作用時,便形成monomer。Monomer結構對作用中的hPP而言更顯得重要。透過短片段序列減少dimer的發生機會,並研究短片段狀況下是否依然具有規則結構。
我們研究hPP【17-24】序列,位於hPP α-helical部分。利用SPPS來合成hPP【17-24】,透過HPLC分離及純化並送測Mass鑑定分子量。最後利用CD及2D NMR實驗來研究hPP【17-24】在100%H2O與50%TFE / 50%H2O溶液下的結構。結果發現hPP【17-24】在兩種溶液中均喪失α-helical結構。hPP【17-24】在100%H2O中以Random coil形式存在;在50%TFE / 50%H2O溶液下逐漸有規則結構形成。
英文摘要 The human pancreatic polypeptide(hPP), a 36-residue, polypeptide hormone is a member of the neuropeptide Y(NPY)family. In the central nervous system PP promotes food intake and gastric emptying by activation of the Y4 and probably Y5 receptors. The C-terminal is a well-defined α-helical region and the N terminus is an extended polyproline helix which bent back onto the the C-terminalα-helix. The structural motif of pp has been named as the PP-fold. hPP in solution exists as a dimer and when bound to micelle, it exists as a monomer. Therefore, to elucidate the monomer structure is important. Short peptide fragment may avoid dimmer formation and reveal the folding dynamoics of hpp.
We studied hPP[17-24] ,of α-helical region, and used SPPS method for synthesizing the residues17-24.Isolation and purification were performed by HPLC and the molecular weight were made sure by Mass. The conformation and dynamics of hPP[17-24] in different solvent condition is studied by CD and 2D NMR experiment. Conformation of hPP[17-24] exists as a random coil in 100%H2O and become more regular in 50%TFE / 50%H2O of hPP[17-24].
論文目次 目錄
第一章 序論 1
1.1 NPY家族 2
1.2 PP介紹 6
1.3 結構變化 11
1.4 研究目的 12
第二章 文獻回顧 14
2.1 結構重要性 14
2.2 2D NMR原理 23
2.3 CD原理 38
2.4 SPPS原理 46
第三章 實驗材料與方法
3.1 實驗材料 56
3.2 實驗方法 63
第四章 結果 77
第五章 討論 141
第六章 未來研究 152
參考文獻 153



圖片索引
圖1-1 NPY Family之結構與序列。 3
圖1-2 豬之PYY、NPY與牛的PP在水溶液中單體結構圖。 3
圖1-3 aPP之晶體結構。 8
圖1-4 以NPY序列形成PP-fold。 9
圖1-5 PP與NPY之雙體形式 10
圖1-6 hPP結構變化。 13
圖2-1 胺基酸基本結構。 16
圖2-2 二十種胺基酸分類 16
圖2-3 兩胺基酸脫一分子水形成胜肽鍵。 18
圖2-4 多肽鍵的構成。 18
圖2-5 蛋白質一級結構-胺基酸殘基序列。 20
圖2-6 蛋白質二級結構-a-helix。 20
圖2-7 蛋白質二級結構-b-sheet。 21
圖2-8 蛋白質二級結構-b-turn。 21
圖2-9 蛋白質靠非共價鍵的力量來穩定其三級結構。 22
圖2-10 蛋白質的四種結構關係圖。 22
圖 2-11 各維度脈衝序列。 31
圖2-12 二維核磁共振實驗之脈衝序列可分四個時期。 31
圖2-13 脈衝對磁化量的變化。 32
圖2-14 將t1 線性的增加實驗。 32
圖2-15 傅利葉轉換。 33
圖2-16 COSY脈衝序列。 34
圖2-17 TOCSY脈衝序列。 34
圖2-18 二自旋系統的弛緩。 35
圖2-19 NOESY脈衝序列。 35
圖 2-20 六個殘基經由NOE數據所計算而得的結構。 36
圖2-21 HSQC脈衝序列。 36
圖2-22 光之電場與磁場示意圖。 39
圖2-23 光通過平面極化器後產生單一線性光源。 39
圖2-24 光通過旋光性物質後會產生相角。 40
圖2-25 光通過旋光物質。 40
圖2-26 四種結構的CD吸收圖形。 45
圖2-27 α-helix、β-sheet、random coil、PPⅡ的CD吸收圖形 45
圖2-28 樹脂透過連接劑與胺基酸序列相連接。 46
圖2-29 SPPS簡易過程示意圖。 48
圖2-30 高分子聚合物樹脂。 51
圖2-31 羧基和胺基相互連接形成醯胺。 51
圖2-32 在鹼性條件下除去胺端保護基Fmoc。 51
圖2-33 在酸性條件下除去胺端保護基BOC。 51
圖2-34 Fmoc為胺端保護基的胺基酸。 53
圖2-35 SPPS合成步驟流程圖。 53
圖2-36 Ninhydrin Test之反應式。 圖2-37 Ninhydrin反應後所呈現的顏色。 54
圖3-1 Rink Amide AM Resin切除後會保有NH2。 67
圖3-2 Rink Amide AM Resin分子式。 67
圖3-3 N端保護基及側鏈保護基。 67
圖3-4 TFA亦能將側鏈保護基去除。 67
圖3-5 合成胜肽流程圖。 68
圖3-6 透過PyBop促進每一個胺基酸形成胜肽鍵。 69
圖3-7 降低消旋作用耦合試劑。 69
圖3-8 胺基酸具有Fmoc避免消旋作用發生。 69
圖3-9 切除試劑的選擇。 70
圖3-10 利用胜肽合成儀PS3之胜肽合成過程。 71
圖3-11 HPLC純化之Main Peak。 72
圖3-12 ESI+-Mass圖。 73
圖4-1 hpp【17-24】40%TFE以下CD吸收值。 84
圖4-2 50%TFE~100%TFE中CD吸收值。 85
圖4-3 比較100%H2O及 50%TFECD的吸收值。 86
圖4-4 COSY之20個胺基酸Spin System。 87
圖4-5 TOCSY之20個胺基酸Spin System。 88
圖4-6 hPP【17-24】在90%H2O / 10%D2O中的COSY圖。 89
圖4-7 hPP【17-24】Leu在COSY光譜的Assignment。 90
圖4-8a hPP【17-24】Ala在COSY光譜的Assignment。 91
圖4-8b hPP【17-24】Ala在TOCSY光譜的Assignment。 92
圖4-9 hPP【17-24】Tyr在COSY光譜的Assignment。 93
圖4-10a hPP【17-24】Tyr在TOCSY光譜的Assignment。 94
圖4-10b hPP【17-24】Asp在TOCSY光譜的Assignment。 95
圖4-11 hPP【17-24】Met在COSY光譜的Assignment。 96
圖4-12 hPP【17-24】Gln在COSY光譜的Assignment。 97
圖4-13 hPP【17-24】Tyr與Gln側鏈之COSY圖。 98
圖4-14 循序判定法。 99
圖4-15 hPP【17-24】 ROESY圖Sequential的daN。 100
圖4-16 hPP【17-24】ROESY圖Sequential的dbN。 101
圖4-17 hPP【17-24】Ala18 NH~Tyr20NH的ROESY圖。 102
圖4-18 hPP【17-24】Tyr20NH與Aromatic的ROESY圖。 103
圖4-19 hPP【17-24】Ala21 NH~Leu24 NH的ROESY圖。 104
圖4-20 hPP【17-24】Tyr20 Aromatic的ROESY圖。 105
圖4-21 hPP【17-24】在90%H2O / 10%D2O中HSQC圖。 106
圖4-22 hPP【17-24】1H化學位移2ppm以下HSQC光譜。 107
圖4-23 hPP【17-24】1H化學位移3ppm以下HSQC光譜。 108
圖4-24 hPP【17-24】aH位置HSQC光譜。 109
圖4-25 hPP【17-24】Aromatic 1H化學位移HSQC光譜。 110
圖4-26 hPP【17-24】在50%H2O / 50%TFE中之COSY圖。 111
圖4-27 hPP【17-24】Leu在COSY光譜的Assignment。 112
圖4-28 hPP【17-24】Ala在COSY光譜的Assignment。 113
圖4-29 hPP【17-24】Tyr在COSY光譜的Assignment。 114
圖4-30 hPP【17-24】Asp在COSY光譜的Assignment。 115
圖4-31 hPP【17-24】Met在COSY光譜的Assignment。 116
圖4-32 hPP【17-24】Gln在COSY光譜的Assignment。 117
圖4-33 hPP【17-24】Tyr與Gln側鏈之COSY圖。 118
圖4-34 hPP【17-24】NOESY圖Sequential的daN。 119
圖4-35:hPP【17-24】NOESY圖Sequential的daN。 120
圖4-36 hPP【17-24】NOESY圖Sequential的dbN。 121
圖4-37 hPP【17-24】NOESY圖Sequential的dbN。 122
圖4-38 hPP【17-24】Ala18 NH~Tyr20 NH的NOESY圖。 123
圖4-39 hPP【17-24】Ala21 NH~Ala22 NH的NOESY圖。 124
圖4-40 hPP【17-24】Asp23 NH~Leu24 NH的NOESY圖。 125
圖4-41 hPP【17-24】Tyr20 Aromatic的NOESY圖。 126
圖4-42 hPP【17-24】Tyr20 aH的NOESY圖。 127
圖4-43 hPP【17-24】在50%H2O / 50%TFE中HSQC圖。 128
圖4-44 hPP【17-24】1H化學位移2ppm左右HSQC光譜。 129
圖4-45 hPP【17-24】1H化學位移3ppm附近HSQC光譜。 130
圖4-46 hPP【17-24】aH位置HSQC光譜圖。 131
圖4-47 hPP【17-24】Aromatic 1H化學位移HSQC光譜。 132
圖5-1 hPP【15-29】在不同比例TFE下之CD光譜圖。 145
圖5-2 hPP【15-29】在100%H2O與30%TFE CD光譜比較圖。 146
圖5-3 hPP【17-24】與hPP【15-29】CD光譜比較圖。 147
圖5-4 hPP【17-24】在aH、aC與bC之CSI。 148
圖5-5 hPP【17-24】模擬計算結構。 149
圖5-6 hPP【17-24】16個NOE之30個結構堆疊。 150
圖5-7:hPP【17-24】19個NOE之30個結構堆疊。 151




表格索引
表1-1 NPY家族與Y Receptors結合程度與生理作用。 5
表2-1 無序列纏繞下各殘基平均化學位移。 37
表3-1 去保護基與偶合反應時間。 65
表3-2 藥品名稱對照分子量。 65
表3-3 hPP【17-24】分析時所使用的梯度。 72
表3-4 CD儀器操作所有設定之參數。 74
表4-1 20個胺基酸在無序纏捲時各氫的平均化學位移。 133
表4-2 20個胺基酸之aH與aC、bC之標準化學位移。 134
表4-3 hPP【17-24】在90%H2O / 10%D2O中1H化學位移。 135
表4-4 hPP【17-24】在90%H2O / 10%D2O中13C化學位移。 136
表4-5 hPP【17-24】在90%H2O / 10%D2O中的NOE。 137
表4-6 hPP【17-24】在50%H2O / 50%TFE中1H化學位移。 138
表4-7 hPP【17-24】在50%H2O / 50%TFE中13C化學位移。 139
表4-8 hPP【17-24】在50%H2O / 50%TFE中的NOE。 140







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