在第一部份，酵母菌醛類去氫酶4為一種存在於粒腺體內的去氫酶，會被K+離子所活化及需要 NAD+、NADP+ 當作輔酶，當乙醇為碳源的代謝途徑下，ALD4扮演了重要的角色。為了比較醛類去氫酶4和其天然酵素之定性分析，我們先將ALD4基因，利用大腸桿菌 BL21大量的表現 ald4p，並且透過管柱層析之後，測定對不同受質的活性，而 Ald4 天然酵素的部份，利用親和性膠體管柱純化後，比較重組的 ald4p與天然ald4p的活性與在蛋白質的二級與四級構型。

第二部份，酵母菌酒精去氫酶4為存在於細胞質內的去氫酶，會被 Zn2+離子所調控，屬於 MDR家族之一。當 ADH1基因存在的條件之下 adh4p的表現會被抑制，所以我們先利用基因重組的方式將酵母菌基因體中 Adh1基因的部份破壞，再將已連接到 pVT101L的 ADH4基因送進已重組過的基因體之中，再誘導酵母菌 adh4p大量表現，透過管柱層析純化之後，檢測其對於受質膽鹼之動力學活性，並探討此活性與甜菜鹼 （betaine）代謝之關係。

In Part I, aldehyde dehydrogenase 4 of Saccharomyces cerevisiae is a K+-activated mitochondrial enzyme using NAD+ and NADP+ as coenzymes. ALD4 plays a major role during growth on ethanol as carbon source. To compare the characteristics of the purified recombinant ald4p with tose of natural counterpart, we firstly used E.coli for overexpression of ald4p, and followed by purification. Then we made kinetic analysis with various kinds of substrate. In ald4p natural counterpart, we performed kinetic active analysis on the same substrates as for the purified recombinant ald4p after purification by affinity column. We also compared the secondary and tertiary structures between the recombinant ald4p and its natural counterpart.
     In Part II, yeast alcohol dehydrogenase IV exists in the cytosol, is a member of the MDR superfamily and activated by Zn2+. Since adh1 could repress the adh4 expression, we used the one-step gene disruption to knockout the adh1 gene in yeast genome. (BJ2168). We then transform the expression vector pVT101L which contains ADH4 ORF into the ADH1 strain, and over-express adh4p. Finally, we determined the enzyme activities with ethanol and choline after purification. The kinetic properties are discussed in relation to choline-betaine pathway.

目 錄
謝誌                                                     I
中文摘要                                                 II
英文摘要                                                 III
目錄                                                     IV
圖表目錄                                                 XI
第一部分 重組酵母菌醛類去氫酶ALD4p之定性分析: 與其天然酵素之比較
第一章 緒論  ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．   1
第一節S. cerevisiae aldehyde dehydrogenase簡介 ．．．．．   1
第二節Betaine ALD 與 S.cerevisiae ALD ．．．．．．．．． 4
第三節 實驗目的 ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．6
第二章 實驗材料與方法．．．．．．．．．．．．．．．．．  7
第一節	將表現基因轉型至宿主細胞中 ．．．．．．．．   7
1-1 少量質體 DNA 製備 （Ald4-pET43） ．．．．．．  7
1-2 用限制酶處理確認 plasmid DNA （ALD4-pET43）．． 8
1-3 大腸桿菌勝任細胞（competent cell）之配製．．．．  9
1-4 質體轉型至表現載體（transformation）．．．．．．  11
第二節	Ald4p 蛋白質表現與純化 ．．．．．．．．．．． 12
2-1 Alcohol dehydrogenase IV 蛋白質之表現 ．．．．．．12
          2-1.1 超音波破碎細胞（Sonication） ．．．．．．．． 13
   2-1.2 粗抽蛋白質之活性測定 ．．．．．．．．．．  14
2-2蛋白質電泳分析 ．．．．．．．．．．．．．．．  15 
        2-3蛋白質純化．．．．．．．．．．．．．．．．．．． 17
          2-3.1 離子交換膠體純化蛋白質 ．．．．．．．．  17 
           2-3.2 親和性膠體純化蛋白質 ．．．．．．．．．  19
    2-4 梯度電泳分析 （Gradient gel analysis）．．．．．． 20
第三節	 Ald4p 之活性分析 ．．．．．．．．．．．．． 22
3-1蛋白質濃度定量 ．．．．．．．．．．．．．．．  22
3-2純化蛋白質對於不同受質之動力學分析 ．．．．．  23
第四節	Ald4p 之定性分析 ．．．．．．．．．．．．．26
4-1 圓二色偏極光譜分析 ．．．．．．．．．．．． 26
第三章  結果與討論 ．．．．．．．．．．．．．．．．．  27
 第一節 ALD4-pET43質體 DNA片段大小之確認 ．．．．  27
     第二節 Ald4p 之表現 ．．．．．．．．．．．．．．．．  28
        3-2.1 Ald4p表現載體之確認 ．．．．．．．．．．． 28
  3-2.2 Ald4p之大量表現 ．．．．．．．．．．．．． 29
     第三節 Ald4p 之純化 ．．．．．．．．．．．．．．．． 30
       3-3.1 Recombinant Ald4p 之純化．．．．．．．．．  30
           3-3.2 Natural Ald4p 之純化 ．．．．．．．．．．．． 33
   3-3.3 梯度電泳分析 （Gradient gel）．．．．．．．．34
第四節 Ald4p 動力學分析．．．．．．．．．．．．．．  35
     第五節 Ald4p 之 Circular Dichroism spectroscopy分析．．．37
第四章 結論．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．  39
第二部分 啤酒酵母菌酒精去氫酶ADH4之過度表現、純化、與定性     
          分析
 第一章 序論 ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．    40
    第一節 S.cerevisiae alcohol dehydrogenase 簡介．．．．．．  40
    第二節 Zinc 對於 yeast ADHIV之影響 ．．．．．．．．．．  42
    第三節 choline-betaine pathway ．．．．．．．．．．．．    43 
    第四節 實驗目的 ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．  43
第二章 實驗材料與方法 ．．．．．．．．．．．．．．．．．   44
第一部分ADH4-pVT101L 表現載體之製備．．．．．．．．   44
第一節	 ADH4 基因之選殖 ．．．．．．．．．．．．．  44
1-1	ADH4 目標基因之放大 ．．．．．．．．．．．．   44
        1-1.1 引子設計 ．．．．．．．．．．．．．．．．．  44
        1-1.2 模板的製備 ．．．．．．．．．．．．．．．．   45 
        1-1.3 聚合酶連鎖反應 ．．．．．．．．．．．．．．  46 
     1-2 鑑定 PCR 之產物 ．．．．．．．．．．．．．．．  48 
        1-2.1瓊脂凝膠電泳法．．．．．．．．．．．．．．．  48 
        1-2.2溶膠純化 PCR 產物 ．．．．．．．．．．．．． 49 
       1-3基因選殖 ．．．．．．．．．．．．．．．．．．   49 
         1-3.1  PCR 產物片段兩端補 adenine residue ．．．．  50 
1-3.2  接合反應 ．．．．．．．．．．．．．．．．  50  
1-3.3  大腸桿菌 DH5a勝任細胞之製作 ．．．．．   52 
1-3.4  大腸桿菌之質體轉型（transformation） ．．    52 
1-3.5  少量質體 DNA 製備 ．．．．．．．．．．．  53
1-3.6  用限制酶處理確認 plasmid DNA ．．．．．． 53 
1-3.7  定序 ．．．．．．．．．．．．．．．．．． 54
     第二節 次選殖至 pVT101L 
2-1  選殖基因與載體限制酶切位之建構 ．．．．．．． 54
       2-2  選殖基因 ADH4 與表現載體 pVT101L 之接合．． 56
       2-3  大腸桿菌之轉型，轉型至 DH5α ．．．．．．．．56
       2-4  利用限制酶確認片段以篩選正確質體 DNA ．．．．57
第二部分Gene replacement technique ．．．．．．．．．．．．59
   第一節 PCR-Mediated One-Step Gene Disruption ．．．．．． 59
      1-1 引子設計 ．．．．．．．．．．．．．．．．．．    59
      1-2 模板製備 ．．．．．．．．．．．．．．．．．．    60
      1-3 聚合酶連鎖反應．．．．．．．．．．．．．．．．   61
      1-4 以瓊脂凝膠電泳分析 PCR 產物 ．．．．．．．．    62 
      1-5 溶膠純化 PCR 產物 ．．．．．．．．．．．．．    62
       1-6 PCR 產物片段兩端補 adenine residue ．．．．．．．   63
       1-7 基因選殖 ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．    63
      1-8 大腸桿菌 DH5a勝任細胞之製作 ．．．．．．．     63
      1-9 大腸桿菌之質體轉型（transformation）．．．．．．． 63
      1-10 少量質體 DNA 製備．．．．．．．．．．．．．   63
      1-11 用限制酶處理確認 plasmid DNA ．．．．．．．．   64
      1-12 定序．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．  64
      1-13 利用高效率酵母菌電穿孔法將 LEU2 與 BJ2168 進
           行基因重組 ．．．．．．．．．．．．．．．．．． 65
      1-14 確認重組後基因之正確性 ．．．．．．．．．．．． 67第三部分 篩選帶有ADH4基因之Antimycin A- resistant突變種．．  70
   第一節 ADH4-pVT101L 轉型至 LEU2-BJ2168 ．．．．．． 70
1-1	酵母菌勝任細胞的製備與轉型作用 ．．．．．．．． 70
1-2	第一次篩選  轉盤至 SC-Leu、Zn2+  固態培養基．． 72
1-3	 第二次篩選 轉盤至 SC- Leu、Zn2+、＋antimycin A固態培養基．．．．．．．．．．．．．．．．  73
第四部分 Adh4p 蛋白質之活性分析 ．．．．．．．．．．．    74第三章 結果與討論．．．．．．．．．．．．．．．．．．．    76
    第一節 ADH4-pVT101L 之製備 ．．．．．．．．．．．．  76  
       1-1聚合酶連鎖反應（PCR）之結果 ．．．．．．．．．  76
       1-2 TA-cloning 確認結果 ．．．．．．．．．．．．．． 77
       1-3 ADH4與pVT101L之限制酶切位確認結果 ．．．．．78
      1-4確認接合後之產物．．．．．．．．．．．．．．．．78
    第二節Gene replacement ．．．．．．．．．．．．．．．．80
       2-1 LEU2 基因利用聚合酶連鎖反應放大（PCR）之結果．80 
       2-2 TA-cloning 結果確認 ．．．．．．．．．．．．．．．81
       2-3利用聚合酶連鎖反應（PCR）來確認基因重組之結果． 82 
    第三節 ADH4 基因突變之篩選結果 ．．．．．．．．．． 84  
       3-1利用 SC-Leu、Zn2+ 固態培養基進行第一次篩選．．．84  
 3-2 轉盤至 SC- Leu、Zn2+、＋antimycin A 固態培養
           基進行第二次篩選之結果．．．．．．．．．．．．  84 
        3-3 以 SDS-PAGE 檢測篩選之結果 ．．．．．．．．． 85
    第四節Adh4p蛋白質活性分析之結果  ．．．．．．．．．  87
第四章 結論．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． 88
參考文獻．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．89
附錄
附錄一、 pGEM-T easy vector 之特徵圖．．．．．．．．．．．   93
附錄二、 Dropout powder 的營養成分及濃度表．．．．．．．．   94
附錄三、 DNA ladder 對照濃度圖．．．．．．．．．．．．．．   95
附錄四、 pVT101L 之特徵圖．．．．．．．．．．．．．．．．   96
附錄五、 實驗儀器．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．   97




















                      圖表目錄
圖1：酵母菌 PDH bypass 代謝途徑 ．．．．．．．．．．．．． 2
圖2：choline-betaine pathway．．．．．．．．．．．．．．．．． 4
圖3：choline-betaine pathway及其相關參與的反應．．．．．．．  4
圖4：利用限制酶NdeI及SpeI確認ALD4-pET43之片段大小．． 27
圖5：Ald4p表現載體以限制酶確認之結果．．．．．．．．．．  28
圖6：Ald4p誘導表現之結果．．．．．．．．．．．．．．．．  29
圖7：Q SepharoseTM Fast Flow純化Ald4p之結果．．．．．．．． 31
圖8：Q SepharoseTM Fast Flow純化Ald4p之結果．．．．．．．． 31
圖9：Blue SepharoseTM 6 Fast Flow純化Recombinant Ald4p之結
       果．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． 32
圖10：Blue SepharoseTM 6 Fast Flow純化Natural Ald4p之結
       果．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． 33
圖11：Natural和Recombinant Ald4p以Native page電泳分析之結
       果．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． 34
圖12：利用SSE程式計算Recombinant和Natural Ald4p之二級結
       構．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． 37
圖13： S.cerevisiae 之 respiratory chain．．．．．．．．．．．  41
圖14： 在無氧的條件下進行 ethanol-acetaldehyde shuttle．．．． 41
圖15： ADH4聚合酶連鎖反應之結果．．．．．．．．．．．． 76
圖16： ADH4與pGEM-T easy vector用限制酶確認之結果．．． 77
圖17：insert ADH4與plasmid pVT101L用限制酶切下切位之結
        果．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． 78
圖18：ADH4與 pVT101L接合完後利用限制酶進行確認．．．． 79
圖19：LEU2聚合酶連鎖反應之結果．．．．．．．．．．．．． 80
圖20：LEU2與pGEM-T easy vector以限制酶確認之結果．．．． 81
圖21-1：以聚合酶連鎖反應確認基因重組之正確性．．．．．．． 82
圖21-2：以聚合酶連鎖反應確認基因重組之正確性．．．．．．． 83
圖22：利用SC- Leu、Zn2+ 固態培養基進行第一次篩選之結果．． 84
圖23：利用SC- Leu、Zn2+＋antimycin A 固態培養基進行第二次篩選　
　　　之結果．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． 84
圖24：Adh4p誘導表現與未誘導以及與含有Zn2+ 液態培養液之比
       較．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．   85
圖25：Adh4p以 +Zn2+ 和 -Zn2+ 液態培養基誘導表現之比較．． 86
圖 27：未誘導與有誘導　Adh4p 的粗抽蛋白質以乙醇為受質，偵測
　　　其催化活性．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．  87
圖28：偵測含過度表現 Adh4p 的粗抽蛋白質對 choline 的活性． 87


表1  酵母菌 Aldehyde dehydrogenase 之家族．．．．．．．．． 3
表2  以限制酶處理ALD4-pET43之成分表．．．．．．．．．． 9
表3  測定Ald4p粗抽蛋白質活性之反應成分．．．．．．．．． 14
表4  SDS-PAGE分離膠體之成分．．．．．．．．．．．．．．  15
表5  SDS-PAGE焦集膠體之成分．．．．．．．．．．．．．．  16
表6  Gradient native gel焦集膠體成分 ．．．．．．．．．．．． 21
表7  Ald4p測定對propionaldehyde活性之反應成分．．．．．． 23
表8  Ald4p測定對Betaine aldehyde活性之反應成分．．．．．． 24
表9  Ald4p測定對γ-aminobutyraldehyde活性之反應成分．．．． 24
表10  Ald4p測定對3-aminopropionaldehyde活性之反應成分．．． 25 
表11  Recombinant和Natural Ald4p動力學分析統計表．．．．． 35
表12  Recombinant和Natural Ald4p之 Vmax 和KM．．．．．． 36
表13  Recombinant和Natural Ald4p之kcat．．．．．．．．．． 36
表14  利用SSE程式計算Recombinant和Natural Ald4p之二級結構
       組成．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． 37
表15  利用CONTILL程式計算Recombinant和Natural Ald4p 之二級結構組成．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．   38
表16  ADH4基因之PCR反應成分．．．．．．．．．．．．． 47
表17  ADH4基因PCR產物補 adenine residue 之反應溶液．．． 50
表18  ADH4基因接合反應之溶液．．．．．．．．．．．．．  51
表19  以限制酶處理pGEM-T-ADH4之成分表 ．．．．．．．． 53
表20  ADH4與pVT101L以限制酶XhoI建構切位之成分．．．． 55
表21  ADH4與pVT101L以限制酶BamHI建構切位之成分．．． 55
表22  ADH4與pVT101L接合反應成分表．．．．．．．．．． 56
表23  LEU2基因PCR反應之成分．．．．．．．．．．．．．  62
表24  pGEM-T-LEU2 以限制酶處理之成分表．．．．．．．．． 64
表25  SC-LEU固態培養基之成分．．．．．．．．．．．．．． 65
表26  確認重組基因正確性之PCR反應成分表．．．．．．．． 69
表27  PTLAD 緩衝液之成分．．．．．．．．．．．．．．．． 70
表28  TE/LiOAc/DTT 緩衝液之成分．．．．．．．．．．．．  71
表29  測定Adh4p對乙醇活性之反應成分．．．．．．．．．．  75
表30  測定Adh4p對choline活性之反應成分．．．．．．．．． 75

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