淡江大學覺生紀念圖書館 (TKU Library)
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系統識別號 U0002-1507201415132100
中文論文名稱 Paenibacillus sp. TKU035生產胞外多醣之條件及特性分析
英文論文名稱 Production and characterization of exopolysaccharides from Paenibacillus sp. TKU035
校院名稱 淡江大學
系所名稱(中) 化學學系碩士班
系所名稱(英) Department of Chemistry
學年度 102
學期 2
出版年 103
研究生中文姓名 陳薏如
研究生英文姓名 Yi-Ru Chen
學號 601160418
學位類別 碩士
語文別 中文
第二語文別 英文
口試日期 2014-07-03
論文頁數 74頁
口試委員 指導教授-王三郎
委員-王全祿
委員-梁慈雯
委員-王三郎
中文關鍵字 Paenibacillus sp.  胞外多醣  烏賊軟骨粉 
英文關鍵字 Paenibacillus sp.  exopolysaccharide  squid pen powder 
學科別分類 學科別自然科學化學
中文摘要 菌株TKU035係以烏賊軟骨粉為唯一碳/氮源,篩選自台灣北部土壤之一株胞外多醣及生物界面活性劑生產菌,經鑑定為Paenibacillus sp.。TKU035生產胞外多醣之較適培養條件為含有2%烏賊軟骨粉、0.1% K2HPO4及0.05% MgSO4.7H2O之100 mL液態培養基(pH 4)於37℃下震盪培養4天(150 rpm)。
TKU035發酵所得上清液(4.03 g/L)經脫色、沉澱並利用Sevag reagent去蛋白,可得水溶性粗胞外多醣,再將粗胞外多醣以陰離子交換樹脂進行純化,所得純化之胞外多醣藉由HPLC分析得知其分子量約為5.07×104 Da。將胞外多醣(20 mg)利用4M鹽酸(10 mL)在90℃下水解5天,對水透析並收集含有胞外多醣分解成寡醣類物質之外液,利用核磁共振(NMR)光譜及基質輔助雷射脫附游離飛行時間質譜儀(MALDI-TOF)分析其寡醣組成。
此外,培養第5天所得發酵上清液有較高的DPPH清除能力(75%)及較佳的總酚含量、還原力。微生物抑制測試顯示,TKU035之發酵上清液對黴菌(Fusarium oxysporum)和細菌(E. coli、Pseudomonas aeruginosa K187)皆有抑制效果。
英文摘要 In this study, an exopolysaccaride(EPS) and biosurfactant-producing strain was isolated from the soil in the northern Taiwan by using squid pen powder (SPP) as the sole carbon/nitrogen source and identified as Paenibacillus sp.. The optimal condition for EPS production was in 100 mL medium containing 2% squid pen powder(SPP), 0.1% K2HPO4 and 0.05% MgSO4•7H2O(pH 4) incubation at 37oC for 4 days(150 rpm).
The water-soluble crude EPS was obtained from the culture supernatant (4.03 g/L) by decoloring, precipitating and deproteinization with Sevag reagent. The crude EPS obtained was then purified subsequently by DEAE-Sepharose. The purified EPS showed molecular weight of 5.07 × 104 Da by HPLC. The EPS was hydrolyzed by 4M HCl at 90oC for 5 days, and the oligosaccharides obtained were collected by dialyzing against water. The oligosaccharide components were analyzed by using nuclear magnetic resonance (NMR) and matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF).
Additionally, DPPH free radical scavenging ability, total phenolic contents and reducing activity were all found highest at the 5th day-culture supernatant. TKU035 culture supernatant also showed antimicrobial activities against fungus of Fusarium oxysporum and bacteria of E. coli and Pseudomonas aeruginosa K187.
論文目次 目錄
頁次
簽名頁
授權書
致謝••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••I
中文摘要•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••II
英文摘要••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••III
目錄••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••IV
圖目錄•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••VIII
表目錄••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••X

第一章 緒論••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••1

第二章 文獻回顧••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••2
2.1 類芽孢桿菌(paenibacillus)之簡介•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••2
2.2 界面活性劑(surfactant)••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••3
2.3 胞外多醣(exopolysaccharide,EPS)••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••6
2.4 抗氧化力(antioxidant potency)•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••11
2.4.1 自由基(free radical)和活性氧物種(reactive oxygen species, ROS)•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••11
2.4.2 抗氧化劑(antioxidant)••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••11
2.5 幾丁質(chitin)•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••13

第三章 材料與方法•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••15
3.1 實驗菌株•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••15
3.2 實驗材料•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••15
3.3 實驗儀器•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••16
3.4 實驗方法•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••17
3.4.1 菌株篩選••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••17
3.4.2 表面張力測量••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••17
3.4.3 總醣測定(H2SO4-Phenol法)•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••18
3.4.4 還原醣測定(DNS法)•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••18
3.5 EPS較適生產條件探討••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••19
3.5.1 碳/氮源濃度探討••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••19
3.5.2 培養基體積探討•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••19
3.5.3 培養通氣量探討•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••20
3.5.4 培養溫度探討••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••20
3.5.5 培養基酸鹼值探討••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••21
3.5.6 培養時間探討••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••21
3.6 EPS之分離純化•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••21
3.6.1 EPS之脫色與沉澱••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••21
3.6.2 EPS之去蛋白••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••22
3.6.3 EPS之陰離子交換樹脂••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••22
3.7 EPS之分子量測定•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••23
3.8 抗氧化活性測試••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••23
3.8.1 DPPH自由基清除能力測定•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••23
3.8.2 總酚含量測定••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••24
3.8.3 還原力測定•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••25
3.9 微生物生長抑制試驗••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••25
3.9.1 黴菌抑制試驗••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••25
3.9.2 細菌抑制試驗••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••26
3.10 EPS水解••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••26
3.11 NMR測定••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••26

第四章 結果與討論•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••28
4.1 生物界面活性劑/胞外多醣生產菌之篩選•••••••••••••••••••••••••••••••28
4.2 菌株鑑定•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••30
4.3 EPS較適生產條件探討••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••34
4.3.1 碳/氮源濃度探討••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••34
4.3.2 培養基體積探討•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••34
4.3.3 培養通氣量探討•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••34
4.3.4 培養溫度探討••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••35
4.3.5 培養基酸鹼值探討••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••35
4.3.6 培養時間探討••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••35
4.3.7 EPS較適生產條件••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••36
4.4 抗氧化分析••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••42
4.4.1 DPPH自由基清除能力測定•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••42
4.4.2 總酚含量測定••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••43
4.4.3 還原力測定•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••43
4.4.4 綜合結果••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••44
4.5 微生物生長抑制之探討•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••50
4.5.1 黴菌抑制率之探討••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••50
4.5.2 細菌抑制率之探討••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••50
4.5.3 綜合結果••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••51
4.6 胞外多醣分析與鑑定••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••55
4.6.1 胞外多醣製備••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••55
4.6.2 胞外多醣去蛋白•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••55
4.6.3 胞外多醣之純化•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••55
4.6.4 胞外多醣之分子量分析••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••56
4.6.5 胞外多醣之結構分析•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••56

第五章 結論••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••65

參考文獻••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••66

圖目錄
頁次
圖3.1 DPPH與抗氧化劑之反應•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••24
圖4.1 碳/氮源濃度對Paenibacillus sp. TKU035生產生物界面活性劑之影響•••29
圖4.2 Paenibacillus sp. TKU035之16S rDNA部分鹼基序列•••••••••••••••••••••••31
圖4.3 TKU035進行NCBI/BLAST比對結果•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••32
圖4.4 不同碳氮源濃度對TKU035生產胞外多醣之影響••••••••••••••••••••••••••••37
圖4.5 不同培養體積對TKU035生產胞外多醣之影響•••••••••••••••••••••••••••••••37
圖4.6 不同的培養通氣量對TKU035生產胞外多醣之影響•••••••••••••••••••••••••38
圖4.7 不同培養溫度對TKU035生產胞外多醣之影響•••••••••••••••••••••••••••••••38
圖4.8 不同培養基酸鹼值對TKU035生產胞外多醣之影響•••••••••••••••••••••••••39
圖4.9 培養時間對TKU035生產胞外多醣之影響•••••••••••••••••••••••••••••••••••••39
圖4.10 不同培養基酸鹼值對TKU035細菌生長之影響••••••••••••••••••••••••••••••40
圖4.11 不同發酵時間之TKU035上清液對DPPH自由基清除率的影響•••••••••45
圖4.12 沒食子酸(gallic acid)之標準曲線•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••47
圖4.13 不同發酵時間之TKU035上清液對總酚含量的影響••••••••••••••••••••••••47
圖4.14 半胱胺酸(cysteine)之標準曲線•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••48
圖4.15 不同發酵時間之TKU035上清液對還原力的影響•••••••••••••••••••••••••••48
圖4.16 DPPH自由基清除能力、總酚含量與還原力之關係圖•••••••••••••••••••••49
圖4.17 不同發酵時間之TKU035上清液對F. O抑制活性的影響•••••••••••••••••52
圖4.18 不同濃度之TKU035-D3上清液對F. O抑制活性的影響••••••••••••••••••52
圖4.19 不同發酵時間之TKU035上清液對E. coli抑制活性的影響••••••••••••••53
圖4.20 不同濃度之TKU035-D3上清液對E. coli抑制活性的影響••••••••••••••••53
圖4.21 不同發酵時間之TKU035上清液對K187抑制活性的影響••••••••••••••••54
圖4.22 不同濃度之TKU035-D3上清液對K187抑制活性的影響•••••••••••••••••54
圖4.23 Paenibacillus sp. TKU035生產胞外多醣製備流程圖••••••••••••••••••••••••57
圖4.24 胞外多醣去蛋白流程圖••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••58
圖4.25 胞外多醣之DEAE-SepharoseTM Fast Flow層析圖譜••••••••••••••••••••••••59
圖4.26 PSS-pulkit(Kit Pullulan 10 × 0.1g, Mp 342 - 48,800 Da)之HPLC層析圖•60
圖4.27 胞外多醣之1H-NMR光譜••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••61
圖4.28 胞外多醣以HCl水解後之1H-NMR光譜••••••••••••••••••••••••••••••••••••••62
圖4.29 胞外多醣以HCl水解後之13C -NMR光譜••••••••••••••••••••••••••••••••••••63
圖4.30 胞外多醣以HCl水解後之MALDI-TOF光譜••••••••••••••••••••••••••••••••64

表目錄
頁次
表2.1 類芽孢桿菌的應用•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••3
表2.2 微生物所生產生物界面活性劑之主要類型•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••5
表2.3 胞外多醣之性質與功能特性•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••8
表2.4 胞外多醣生產菌之生長環境•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••10
表2.5 常見的天然抗氧化劑之種類•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••12
表2.6 幾丁質經X-ray繞射雙股螺旋及對稱軸分子的排列方向••••••••••••••••••••14
表3.1 DNS試劑的組成••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••19
表4.1 Paenibacillus sp. TKU035之16S rDNA部分鹼基序列比對結果•••••••••••33
表4.2 TKU035胞外多醣之較適生產條件•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••40
表4.3 微生物生產之胞外多醣特性比較•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••41
表4.4 微生物來源之DPPH自由基清除能力比較•••••••••••••••••••••••••••••••••••••46
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