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系統識別號 U0002-1407200921511600
中文論文名稱 利用NMR方法研究NPY分子片段的自結合狀態
英文論文名稱 Associate state of NPY fragment investigated by NMR methods
校院名稱 淡江大學
系所名稱(中) 化學學系碩士班
系所名稱(英) Department of Chemistry
學年度 97
學期 2
出版年 98
研究生中文姓名 謝宛倫
研究生英文姓名 Wan-Lun Hsieh
學號 696160679
學位類別 碩士
語文別 中文
口試日期 2009-06-17
論文頁數 132頁
口試委員 指導教授-李長欣
委員-林達顯
委員-鄧金培
中文關鍵字 神經胜肽Y  固相胜肽合成儀  核磁共振  圓二色旋光光譜  化學位移 
英文關鍵字 NPY  SPPS  CD  NMR  CSI 
學科別分類 學科別自然科學化學
中文摘要 神經胜肽Y(neuropeptide Y,NPY)是神經胜肽家族的成員之一,最早是在1982年由豬的大腦分離出來的。成員的特色為均含有36個胺基酸殘基和在C端皆修飾為NH2。hNPY主要分布在中樞和末梢神經系統中,掌控人體許多重要的生理功能。這些功能是藉由hNPY 的C端α-helix與受器作用而產生的。
我們利用固相胜肽合成儀合成hNPY (20-36),經由高效能液相層析儀純化,質譜儀確認分子量後,再利用圓二色光譜儀觀察不同比例TFE溶液下,二級結構的變化。最後在利用NMR實驗,如TOCSY、NOESY、DOSY和[13C,1H]-HSQC來研究NPY片段的結合狀態。
將NOE輸入X-PLOR經過距離幾何和分子動力計算,我們得到在310K、298K和283K的結構分別為α-helix由L24到R35、R25到R33和A23到Q34。DOSY實驗中,我們發現在30% TFE-d3下結構可能為雙體或三聚體;在10% D2O下,結構傾相為單體。
英文摘要 Neuropeptide Y (NPY) is a member of the NPY family, contain 36 residues and is C-terminally amidate. It was first isolated from porcin brain at 1982 and was show to be the most abundant neuropeptide in the mammalian central nervous system, but is also widely expressed in the peripheral nervous system. The variety of physiological effects attributed to NPY are the result of its activity at Y receptors by C-terminal α-helix.
We synthesized hNPY (20-36) by SPPS, purified by HPLC and made sure the molecular weight by Mass. Using NMR data, TOCSY, NOESY, DOSY and [13C, 1H]-HSQC, to investigate associate state of the NPY fragment.
NOE data were used as input for distance geometry, molecule dynamic calculation in X-PLOR. We observed the peptide conformation showed α-helix at L24-R35, R25-33 and A23-Q34 at 310 K, 298 K and 283 K, respectively. In DOSY data,we obtained that the structure may be a dimmer or trimer which existed in 30% TFE-d3. In addition, it may show the structure with monomer in 10% D2O.
論文目次 第一章 緒論
1.1 神經胜肽家族 1
1.2 PP、PYY和NPY在水溶液中的結構 4
1.3 PP、PYY和NPY與micelle結合的結構 7
1.4 研究目的 10
第二章 實驗原理
2.1 固相胜肽合成法 11
2.2 圓二色旋光光譜儀(Circular Dichroism Spectrometer)16
2.3 二維核磁共振 23
2.3-1 COSY實驗 25
2.3-2 TOCSY實驗 27
2.3-3 NOESY實驗 28
2.3-4 HSQC實驗 31
2.3-5 DQF-COSY實驗 32
2.3-6 DOSY實驗 34
2.4 化學位移指數 36
2.5 結構計算 39
第三章 實驗材料與方法
3.1 實驗材料 41
3.2 實驗方法 45
3.2-1 胜肽合成 46
3.2-2 純化與分子量鑑定 52
3.2-3 Circular Dichroism 55
3.2-3 NMR 56
3.2-4 結構計算 58
3.2-5 黏度的量測 61
第四章 實驗結果和討論
4.1圓二色旋光光譜 62
4.2核磁共振 65
4.2-1光譜 65
4.2-2 化學位移 105
4.2-3 結構計算 117
第五章 結 論 129
第六章 參考資料 130

表目錄
表1-1:Y receptors與NPY家族胜肽的結合程度及生理反應。 3
表3-1:合成時所使用活化、耦合和去保護的時間整合。 50
表3-2:藥品的分子量對照表 50
表3-3: 純化hnpy (20-36)片段時所使用的梯度。 52
表3-4:圓二色光譜儀的實驗參數。 55
表3-5:30% TFE/70% H20在310K時所使用的參數。 56
表3-6:30% TFE/70% H20在298K時所使用的參數。 57
表3-7:30% TFE/70% H20在283K時所使用的參數。 57
表4-1:NPY (20-36)在30% TFE-d3 DOSY的結果整理表。 100
表4-2:NPY (20-36)在10% D2O DOSY的結果整理表。 104
表4-3:hNPY (20-36)在30% TFE-d3,310 K的1H化學位移。 111
表4-4:hNPY (20-36)在30% TFE-d3,298 K的1H化學位移。 112
表4-5:hNPY (20-36)在30% TFE-d3,283 K的1H化學位 移。 113
表4-6:hNPY (20-36)在30% TFE-d3,310 K的13C化學位移。 114
表4-7:hNPY (20-36)在30% TFE-d3,298 K的13C化學位移。 115
表4-8:hNPY (20-36)在30% TFE-d3 ,283 K的13C化學位移。 116
表4-9:hNPY (20-36)在310 K、298 K和283 K下,計算結構的統計圖。 128

圖目錄
圖1-1:aPP的結晶結構和hNPY、hPYY、hPP的胺基酸序列。 1
圖1-2:分別為pNPY、pNPY和bPP在水溶液中的單體結構。 4
圖1-3:bPP在水溶液形成反平行的雙體結構。 5
圖1-4:pNPY在水溶液中形成雙體結構。 6
圖1-5:bPP與micelle結合後,20個能量最小化的疊圖。 8
圖1-6:pPYY與micelle結合後,20個能量最小化的疊圖。 8
圖1-7:NPY與micelle結合進而與receptors作用的機制。 9
圖1-8:NPY與micelle結合後,20個能量最小化的疊圖。 9
圖2-1:胺基酸的胺基和下一個胺基酸的羧基形成醯胺鍵。 12
圖2-2:鹼性條件下去除Fmoc保護基的反應機制。 12
圖2-3:酸性條件下去除t-BOC保護基的反應機制。 12
圖2-4:固相胜肽合成法流程圖。 14
圖2-5:茚三酮試驗(Ninhydrin test)的反應機制。 15
圖2-6:顯色測試反應。 15
圖2-7:產生圓形偏極光的示意圖。 17
圖2-8:左為非旋光性物質;右為右旋光物質所產生的相角。 18
圖2-9:蛋白質或胜肽的四種主要結構的圓二色旋光光譜。 22
圖2-10:CD光譜圖的參考圖示。 22
圖2-11:二維核磁共振實驗的脈衝序列。 23
圖2-12:在二維核磁共振實驗中,將t1做線性增加。 24
圖2-13:COSY的脈衝序列。 25
圖2-14:TOCSY的脈衝序列。 27
圖2-15:兩個偶極耦合的自旋。 28
圖2-16:兩個相鄰胺基酸之間質子的距離。 29
圖2-17:NOESY的脈衝序列。 29
圖2-18:HSQC的脈衝序列。 32
圖2-19:DQF-COSY的脈衝序列。 33
圖2-20:DOSY的脈衝序列。 35
圖2-21:20種常見的胺基酸在無序纏捲下,αH的化學位移。 38
圖2-22:20種常見的胺基酸在無序纏捲下C的化學位移。 39
圖2-23:連續和非連續的NOE可預測產生特定的二級結構。 40
圖3-1:紅色部分為N端的保護基;黃色部分為側鏈保護基。.......46
圖3-2:以TFA除去樹脂的同時,亦將側鏈保護基去除。 46
圖3-3:Rink Amide AM Resin的結構。 47
圖3-4:Rink Amide AM Resin經切除後會在殘基上保有NH2。 47
圖3-5:耦合試劑(PyBOP、HBTU、PyAOP和HATU)的結構。 48
圖3-6:活化步驟中PyBOP作為耦合劑的反應機制。 48
圖3-7:切除試劑的選用指示圖。 51
圖3-8:HPLC分析圖,主要峰的滯留時間為10.126分鐘。 53
圖3-9:HPLC分析圖,主要峰的滯留時間為10.126分鐘。 53
圖3-10:由 ESI+-Mass測得hnpy (20-26)的分子量為2229.13。 54
圖3-11:由 ESI+-Mass測得hnpy (20-26)的分子量為2229.23。 54
圖4-1:由上而下分別為0%、10%、20%、30%和40% TFE溶液下
的CD光譜疊圖。 63
圖4-2:為0~100% TFE溶液下的CD光譜疊圖。 63
圖4-3:hNPY (20-36)在0% TFE~100% TFE溶液中,二級結構組成的分布圖。 64
圖4-4:hNPY (20-36)在30% TFE-d3 ∕ 70% H2O,310 K的TOCSY光譜。 67
圖4-5:hNPY (20-36)在30% TFE-d3 ∕ 70% H2O,310 K的NOESY光譜,顯示dαN(i,i+1)的NOE連結。 68
圖4-6:hNPY (20-36)在30% TFE-d3 ∕ 70% H2O,310 K的NOESY光譜,顯示dβN(i,i+1)的NOE連結。 69
圖4-7:hNPY (20-36)在30% TFE-d3 ∕ 70% H2O,310 K的NOESY光譜,顯示dNN(i,i+1)的NOE連結。 70
圖4-8:hNPY (20-36)在30% TFE-d3,310 K的NOESY 光譜,顯示dαN(i,i+2)的NOE連結。 71
圖4-9:hNPY (20-36)在30% TFE-d3 ∕ 70% H2O,310 K的NOESY光譜,顯示dαN(i,i+3)的NOE連結。 72
圖4-10:hNPY (20-36)在30% TFE-d3 ∕ 70% H2O,310 K的NOESY光譜,顯示dαN(i,i+4)的NOE連結。 73
圖4-11:hNPY (20-36)在30% TFE-d3 ∕ 70% H2O,310 K的NOESY光譜,顯示dβN(i,i+2)、dβN(i,i+3)和dβN(i,i+4)的NOE連結。 74
圖4-12:hNPY (20-36)在30% TFE-d3 ∕ 70% H2O,310 K的NOESY光譜,顯示dαβ(i,i+3)和dαβ (i,i+4)的NOE連結。 75
圖4-13:hNPY (20-36)在30% TFE-d3/ 70%H2O,310 K的 [13C,1H]-HSQC光譜。 76
圖4-14:hNPY (20-36)在30% TFE-d3 ∕ 70% H2O,298 K的TOCSY 光譜。 77
圖4-15:hNPY (20-36)在30% TFE-d3 ∕ 70% H2O,298 K的NOESY光譜,顯示dαN(i,i+1)的NOE連結。 78
圖4-16:hNPY (20-36)在30% TFE-d3 ∕ 70%H2O,298 K的NOESY光譜,顯示dβN(i,i+1)的NOE連結。 79
圖4-17:hNPY (20-36)在30% TFE-d3 ∕ 70% H2O,298 K的NOESY光譜,顯示dNN(i,i+1)的NOE連結。 80
圖4-18:hNPY (20-36)在30% TFE-d3 ∕ 70% H2O,298 K的NOESY光譜,顯示dαN(i,i+2)的NOE連結。 81
圖4-19:hNPY (20-36)在30% TFE-d3 ∕ 70% H2O,298 K的NOESY光譜,顯示dαN(i,i+3)的NOE連結。 82
圖4-20:hNPY (20-36)在30% TFE-d3,298 K的NOESY 光譜,顯示dαN(i,i+4)的NOE連結。 83
圖4-21:hNPY (20-36)在30% TFE-d3 ∕ 70% H2O,298 K的NOESY光譜,顯示dβN(i,i+2)、dβN(i,i+3)和dβN(i,i+4)的NOE連結。 84
圖4-22:hNPY (20-36)在30% TFE-d3 ∕ 70% H2O,298 K的NOESY光譜, 顯示dαβ(i,i+3)和dαβ (i,i+4)的NOE連結。 85
圖4-23:hNPY (20-36)在30% TFE-d3/ 70% H2O,298 K的[13C,1H]-HSQC光譜。 86
圖4-24:hNPY (20-36)在30% TFE-d3 ∕ 70% H2O,283 K的TOCSY光譜。 87
圖4-25:hNPY (20-36)在30% TFE-d3 ∕ 70% H2O,283 K的NOESY光譜,顯示dαN(i,i+1)的NOE連結。 88
圖4-26:hNPY (20-36)在30% TFE-d3 ∕ 70% H2O,283 K的NOESY光譜,顯示dβN(i,i+1)的NOE連結。 89
圖4-27:hNPY (20-36)在30% TFE-d3 ∕ 70% H2O,283 K的NOESY光譜,顯示dNN(i,i+1)的NOE連結。 90
圖4-28:hNPY (20-36)在30% TFE-d3 ∕ 70% H2O,283 K的NOESY光譜,顯示dαN(i,i+2)的NOE連結。 91
圖4-29:hNPY (20-36)在30% TFE-d3 ∕ 70% H2O,283 K的NOESY光譜,顯示dαN(i,i+3)和dαN(i,i+4)的NOE連結。 92
圖4-30:hNPY (20-36)在30% TFE-d3 ∕ 70% H2O,283 K的NOESY光譜,顯示dβN(i,i+2)的NOE連結。 93
圖4-31:hNPY (20-36)在30% TFE-d3 ∕ 70% H2O,283 K的NOESY光譜,顯示dβN(i,i+3)和dβN(i,i+4)的NOE連結。 94
圖4-32:hNPY (20-36)在30% TFE-d3 ∕ 70% H2O,283 K的NOESY光譜, 顯示dαβ(i,i+3)和dαβ (i,i+4)的NOE連結。 95
圖4-33:hNPY (20-36)在30% TFE-d3/ 70% H2O,283 K的[13C,1H]-HSQC光譜。 96
圖4-34:hNPY (20-36)在30% TFE-d3的DOSY光譜疊圖。 98
圖4-35:hNPY (20-36)在30% TFE-d3 / 70% H2O的各個溫度下的擴散係數值(D)。 99
圖4-36:hNPY (20-36)在30% TFE-d3的各個溫度下的黏度值。 99
圖4-37:hNPY (20-36)在30% TFE-d3 / 70% H2O的各個溫度下所計算出來的分子量。 100
圖4-38:hNPY (20-36)在10% D2O的DOSY光譜疊圖。 102
圖4-39:hNPY (20-36)在10% D2O / 90% H2O的各個溫度下的擴散係數值(D)。 103
圖4-40:hNPY (20-36)在10% D2O的各個溫度下的黏度值。 103
圖4-41:hNPY (20-36)在10% D2O / 90% H2O的各個溫度下所計算得到的分子量。 104
圖4-42:在310K時,hNPY(20-36)片段各個殘基的1H化學位移與無序纏捲相減後的差值。 106
圖4-43:在298K時,hNPY(20-36)片段各個殘基的1H化學位移與無序纏捲相減後的差值。 106
圖4-44:在283K時,hNPY(20-36)片段各個殘基的1H化學位移與無序纏捲相減後的差值。 107
圖4-45:在310K時,hNPY(20-36)片段各個殘基的13C化學位移與無序纏捲相減後的差值。 108
圖4-46:在298K時,hNPY(20-36)片段各個殘基的13C化學位移與無序纏捲相減後的差值。 109
圖4-47:在283K時,hNPY(20-36)片段各個殘基的13C化學位移與無序纏捲相減後的差值。 109
圖4-48:各個殘基在310 K、298K和283 K時,αH化學位移的統整圖。 110
圖4-49:各個殘基在310 K、298K和283 K時,αC化學位移的統整圖。 110
圖4-50:hNPY (20-36)在30% TFE-d3 / 70% H2O,310 K的20個能量最小化後的疊圖。 118
圖4-51:hNPY (20-36)在30% TFE-d3,310 K的三維結構。 118
圖4-52: hNPY (20-36)在30% TFE-d3 ,310 K的Ramachandran plot圖。 119
圖4-53:hNPY (20-36)在30% TFE-d3 / 70% H2O,310 K,所有NOE的連結。 120
圖4-54:hNPY (20-36)在30% TFE-d3 / 70% H2O,298 K的20個能量最小化後的疊圖。 121
圖4-55:hNPY (20-36)在30% TFE-d3,298 K的三維結構。 122
圖4-56: hNPY (20-36)在30% TFE-d3,298 K的Ramachandran plot圖。 122
圖4-57:hNPY (20-36)在30% TFE-d3 / 70% H2O,298 K,所有NOE的連結。 123
圖4-58:hNPY (20-36)在30% TFE-d3 / 70% H2O,283 K的20個能量最小化後的疊圖。 124
圖4-59:hNPY (20-36)在30% TFE-d3,283 K的三維結構。 125
圖4-60: hNPY (20-36)在30% TFE-d3 / 70% H2O,283 K
Ramachandran plot圖。 125
圖4-61:hNPY (20-36)在30% TFE-d3 / 70% H2O,283 K,所有NOE的連結。……………………………………………………126
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