Mastoparan B自黑腹虎頭蜂蜂毒液中分離出，由十四個胺基酸(LKLKSIVSWAKKVL-NH2)所組成，MPB-NH2在水中的構形相當不穩定，而在TFE(三氟乙醇)水溶液中會形成穩定的雙性二級結構(α螺旋)。
    根據前人研究指出，MPB-NH2分子上的第9顆芳香環胺基酸Trp，其強大的疏水特性有助於與細胞膜相互作用，藉此作用可以穩定胜肽分子的二級結構並裂解細胞膜。在MPB-NH2的相關研究當中，把Trp置換成Ala造成MPB-NH2分子兩性結構的破壞，其生物活性也幾乎消失。這些研究表明芳香環胺基酸Trp對MPB-NH2的構型及生物活性扮演很重要的角色。為了更進一步探討芳香環胺基酸對結構與生物活性的影響及關聯性，我們將MPB-NH2分子的第9個位置替換成同樣為疏水性且以苯環為結構的芳香環胺基酸Phe及Tyr。
將MPB-NH2的Trp置換成Tyr，利用固相胜肽合成法(Solid Phase Peptide Synthesis)合成9Y-MPB-NH2，經由高效能液相層析儀(HPLC)純化、MOLDI-TOF確認分子量，再以圓二色光譜儀(CD)和二維核磁共振(2D NMR)光譜：TOCSY、NOESY、[1H,13C]-HSQC光譜判定得到化學位移與NOE資訊﹔弛緩實驗(relaxation)測得9Y-MPB-NH2內部運動的參數T1、T2與NOE ﹔利用DOSY的變溫實驗，測量胜肽分子所產生的聚集現象導致擴散運動的改變，用以估計胜肽在溶液中的分子量，與理論分子量相比較的結果，推測胜肽分子與溶劑分子相互作用下的胜肽聚集行為 。
    經由Xplor計算軟體模擬出9Y-MPB-NH2的二級結構，得知其283K 30%TFE環境下之螺旋結構位於K4-V13；310 K 30%TFE環境下之螺旋結構位於S5-V13。利用無模型法則(Model-free approach)進行分子動態行為計算，計算出9Y-MPB-NH2各殘基的次序參數(order parameter, S2)與全關聯時間(Overall correlation time, τm)。
    另外，我們利用大腸桿菌(E. coli)對MPB-NH2、9F-MPB-NH2和9Y-MPB-NH2做抗菌活性測定，並透過影響抗菌胜肽活性之結構因素來了解為何置換不同芳香環胺基酸會對抗菌活性有所影響。

Mastoparan-B (MPB-NH2) is an antibacterial cationic tetradecapeptide, isolated from the venom of black-bellied hornet (Vespa basalis) with a primary structure
(LKLKSIVSWAKKVL -CONH2) and amide C-terminus. It forms a random coil in aqueous solution and adopts an ampliphlic α-helical conformation in trifluoroethanol(TFE). A previous study showed that Alanine (Ala) in substitution for Trp9 cause a collapse of the helix. The aromatic ring of the tryptophan in MPB-NH2 is important in the helical stabilization. Recognizing this, we attempt to uncover how an aromatic residue affect the structure and the biological activity of MPB-NH2 and its analogous.
  In this study, we replaced Trp9 by phenylalanine and tyrosine in the primary structure of MPB-NH2. Results of CD and NMR indicated no significant change in the helical structure in 30% trifluoroethanol solution.
  However, the experiments of antibacterial activity showed that MPB-NH2 has stronger antibacterial activity than [Phe9]- MPB-NH2and [Tyr9]- MPB-NH2. It is likely that the indole ring of tryptophan residue is more effective for membrane perturbation than benzene ring of phenylalanine and the phenol of tyrosine.
  Also, a number of NOEs have been found between aromatic residue and other residues.
  Here, we proposed that some of these NOEs may imply the fundamental interaction for structure stabilization and activity.

目錄
目錄	i
圖目錄	iv
表目錄	ix
第一章 緒論 	1
1.1 抗菌胜肽	1
1.2 Mastoparan B (MPB-NH2)及Mastoparan (MPs-NH2)家族介紹	4
1.3 研究目的	7
第二章 實驗原理	8
2.1 固相胜肽合成(Solid-Phase Peptide Synthesis, SPPS)	8
2.2 抗菌作用機制	10
2.2.1自我聚集及聚合(self-association and multimerization)	11
2.3 圓二色旋光光譜儀（Circular Dichroism Spectrometer）	14
2.3.1多胜肽之二級結構CD光譜	18
2.4 核磁共振(Nuclear Magnetic Resonance, NMR)	21
2.4.1 二維核磁共振(2D NMR)	27
2.4.1.1 COSY實驗(Correlation Spectroscopy)	29
2.4.1.2 TOCSY實驗(Total Correlation Spectroscopy)	31
2.4.1.3 NOESY實驗(Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy)	32
2.4.1.4 HSQC實驗(Heteronuclear Single Quantum Correlation)	35
2.4.1.5 PFG-NMR DOSY 實驗(Diffusion Ordered NMR Spectroscopy)	36
2.4.1.6二次化學位移指數(Secondary Chemical Shift Index)	40
2.5 結構計算(XPLOR原理)	44
2.6 無模型法則(Model-Free Approach)	45
第三章 實驗方法與材料	49
3.1 實驗材料	49
3.1.1 藥品	49
3.1.2 實驗儀器	51
3.2 實驗方法	52
3.2.1 SPPS (胜肽合成)	53
3.2.1.1 試劑配置	53
3.2.1.2 合成	53
3.2.2 胜肽純化與鑑定	55
3.2.3 抗菌活性測試	57
3.2.4 Circular Dichroism	59
 3.2.4.1 樣品配製	59
3.2.4.2 實驗條件	59
3.2.5 NMR	60
3.2.5.1 樣品配製	60
3.2.5.2 實驗條件	60
3.2.6 結構計算	62
3.2.7 無模型法則(model-free approach)計算	63
第四章 結果與討論	67
4.1 圓二色旋光光譜	67
4.2 DOSY實驗	69
4.2.1 9Y-MPB-NH2在 30% TFE-d3的DOSY光譜	69
4.3 二維核磁共振光譜(2D NMR)	75
4.3.1光譜	75
4.3.1.1 9Y-MPB-NH2 5 mM在30% TFE-d3，283 K	75
4.3.1.2 9Y-MPB-NH2 5 mM在30 % TFE-d3，310 K	89
4.3.2二次化學位移	103
4.4 結構計算	107
4.5 胜肽分子的動態行為	111
4.6 抗菌活性測試(Antibacterial Activity)	121
4.6.1抗E.coli 活性	121
4.6.2影響抗菌胜肽活性之結構因素	123
第五章 結論	134
第六章 參考資料	137
 
圖目錄
圖1-1：經模擬粹熄出來所得到的20個結構疊圖。	4
圖1-2：Mastoparan家族的初級結構示意。	5
圖1-3：MPB-NH2經過置換的螺旋結構圖。	6
圖2-1：固相胜肽合成流程圖。	9
圖2-2：磷脂質(lipid)組成。	10
圖2-3：抗菌胜肽對抗病原菌機制(A) 桶狀式穿鑿機制 (barrel-stave mechanism) (B) 地毯式包覆機制 (carpet mechanism) (C) 超環狀孔洞機制 (toroidal pore mechanism)。 	13
圖2-4：光的電場(E)與磁場(M)示意圖。	14
圖2-5：光通過平面極化器（polarizer）後產生單一線性光源。	15
圖2-6：左圖為通過非旋光性物質；右圖為通過右旋光物質所產生的相角。	15
圖2-7：蛋白質或胜肽的主要結構之圓二色旋光光譜。	18
圖2-8：二級結構-螺旋。	19
圖2-9：二級結構-摺板。	20
圖2-10：random coil。	20
圖2-11：原子核在磁場B0下產生的磁矩μ繞著磁場進動，頻率為ω。	22
圖2-12：原子在靜磁場中的能量分裂。	22
圖2-13：原子核吸收RF pulse 能量，產生能階狀態的躍遷。	23
圖2-14：整個系統磁矩向量總和M0 產生示意圖。	23
圖2-15：M0受電磁脈衝偏轉到XY平面。	24
圖2-16：M0在Z軸與XY平面弛緩的簡易圖。 	25
圖2-17：Mz’和Mx’-y’與T1、T2關係式與關係圖。	26
圖2-18：弛緩過程中，原子核能階變化圖。	26
圖2-19：二維核磁共振實驗的脈衝序列。	27
圖2-20：將t1 線性的增加實驗。	28
圖2-21：COSY的脈衝序列。	29
圖2-22：TOCSY的脈衝序列。	31
圖2-23：兩個相鄰胺基酸之間質子的距離。	32
圖2-24：兩個偶極耦合的自旋，I 和S 的弛緩路徑，W0、W1 和W2 分別表示零量子、單量子和雙量子的躍遷。	33
圖2-25：NOESY 為2D 的NOE 實驗，其脈衝序列。	33
圖2-26：HSQC 實驗的脈衝序列。	36
圖2-27：Diffusion的脈衝序列。	38
圖2-28：Dephasing 過程。	40
圖3-1：9Y-MPB-NH2 經過一次純化後的HPLC分析圖，主要峰的滯留時間約在15分鐘。	55
圖3-2：經由MOLDI-TOF測得9Y-MPB-NH2分子量為1588.907。	56
圖4-1：9Y-MPB-NH2在300 K不同TFE濃度下的CD光譜圖。	68
圖4-2：濃度為5 mM的9Y-MPB-NH2在10 % D2O/ 30 %TFE-d3/ 60 %H2O水溶液中，pH 4.02的條件下之DOSY光譜疊圖。縱軸座標為擴散係數，橫軸座標為1H之化學位移(溫度為310 K )。	71
圖4-3：在不同溫度下使用黏度管測量黏度的變化在30 % TFE。	72
圖4-4：MPB-NH2、9F-MPB-NH2以及9Y-MPB-NH2利用DOSY 光譜求得在不同溫度下擴散係數。	72
圖4-5：MPB-NH2、9F-MPB-NH2以及9Y-MPB-NH2利用DOSY光譜求得再不同溫度下實驗計算出來的實驗分子量(Mexp)與理論分子量(M)之倍數關係。 	73
圖4-6：濃度為5 mM的9Y-MPB-NH2在10 % D2O/ 30 %TFE-d3/ 60 %H2O水溶液中，溫度為283 K，pH 4.0的條件下之TOCSY光譜圖。	76
圖4-7：濃度為5 mM的9Y-MPB-NH2在10% D2O/ 30%TFE-d3/ 60%H2O水溶液中，溫度為283 K，pH 4.02的條件下之NOESY光譜圖顯示，dαN(i,i+1)的NOE連結。	77
圖4-8：濃度為5 mM的9Y-MPB-NH2在10% D2O/ 30%TFE-d3/ 60%H2O水溶液中，溫度為283 K，pH 4.02的條件下之NOESY光譜圖，顯示dβN(i,i+1)的NOE連結。	78
圖4-9：濃度為5 mM的9Y-MPB-NH2在10% D2O/ 30 %TFE-d3/ 60 %H2O水溶液中，溫度為283 K，pH 4.02的條件下之NOESY光譜圖，顯示dNN(i,i+1)的NOE連結。	79
圖4-10：濃度為5 mM的9Y-MPB-NH2在10 % D2O/ 30%TFE-d3/ 60 %H2O水溶液中，溫度為283 K，pH 4.02的條件下之NOESY光譜圖，顯示dαN(i,i+2)、dαN(i,i+3)、dαN(i,i+4)的NOE連結。	80
圖4-11：濃度為5 mM的9Y-MPB-NH2在10 % D2O/ 30 %TFE-d3/ 60 %H2O水溶液中，溫度為283 K，pH 4.02的條件下之NOESY光譜圖，顯示dβN(i,i+2)、dβN(i,i+3)和dβN(i,i+4)的NOE連結。	81
圖4-12：濃度為5 mM的9Y-MPB-NH2在10 % D2O/ 30 %TFE-d3/ 60 %H2O水溶液中，溫度為283 K，pH 4.02的條件下之NOESY光譜圖，顯示dαβ(i,i+3)、dαβ(i,i+4)的NOE連結。	82
圖4-13：濃度為5 mM的9Y-MPB-NH2在10 % D2O/ 30 %TFE-d3/ 60 %H2O水溶液中，溫度為283 K，pH 4.02的條件下之TOCSY光譜圖，圖中標示了胺基酸芳香環質子的判定。	83
圖4-14：濃度為5 mM的9Y-MPB-NH2在10 % D2O/ 30 %TFE-d3/ 60 %H2O水溶液中，溫度為283 K，pH 4.02的條件下之[13C,1H]-HSQC光譜。	84
圖4-15：濃度為5 mM的9Y-MPB-NH2在10% D2O/ 30 %TFE-d3/ 60 %H2O水溶液中，溫度為283 K，pH 4.02的條件下之NOESY光譜圖，顯示Tyr9上2,6H及3,5H與其他胺基酸的NOE訊號。	85
圖4-16：濃度為5 mM的9Y-MPB-NH2在10 % D2O/ 30 %TFE-d3/ 60 %H2O水溶液中，溫度為310 K，pH 4.0的條件下之TOCSY光譜圖。	90
圖4-17：濃度為3.70 mM的9Y-MPB-NH2在10% D2O/ 30%TFE-d3/ 60%H2O水溶液中，溫度為310 K，pH 4.02的條件下之NOESY光譜圖顯示，dαN(i,i+1)的NOE連結。	91
圖4-18：濃度為5 mM的9Y-MPB-NH2在10% D2O/ 30%TFE-d3/ 60%H2O水溶液中，溫度為310 K，pH 4.02的條件下之NOESY光譜圖，顯示dβN(i,i+1)的NOE連結。	92
圖4-19：濃度為5 mM的9Y-MPB-NH2在10 % D2O/ 30%TFE-d3/ 60 %H2O水溶液中，溫度為310 K，pH 4.02的條件下之NOESY光譜圖，顯示dαN(i,i+2)、 dαN(i,i+3)、dαN(i,i+4)的NOE連結。	93
圖4-20：濃度為5 mM的9Y-MPB-NH2在10 % D2O/ 30 %TFE-d3/ 60 %H2O水溶液中，溫度為310 K，pH 4.02的條件下之NOESY光譜圖，顯示dβN(i,i+2)、dβN(i,i+3)和dβN(i,i+4)的NOE連結。	94
圖4-21：濃度為5 mM的9Y-MPB-NH2在10 % D2O/ 30 %TFE-d3/ 60 %H2O水溶液中，溫度為310 K，pH 4.02的條件下之NOESY光譜圖，顯示dαβ(i,i+3)、dαβ(i,i+4)的NOE連結。	95
圖4-22：濃度為5 mM的9Y-MPB-NH2在10% D2O/ 30 %TFE-d3/ 60 %H2O水溶液中，溫度為310 K，pH 4.02的條件下之NOESY光譜圖，顯示dNN(i,i+1)的NOE連結。	96
圖4-23：濃度為5 mM的9Y-MPB-NH2在10 % D2O/ 30 %TFE-d3/ 60 %H2O水溶液中，溫度為310 K，pH 4.02的條件下之[13C,1H]-HSQC光譜。	97
圖4-24：濃度為5 mM的9Y-MPB-NH2在10 % D2O/ 30 %TFE-d3/ 60 %H2O水溶液中，溫度為310K，pH 4.02的條件下之TOCSY光譜圖，圖中標示了胺基酸芳香環質子的判定。	98
圖4-25：濃度為5 mM的9Y-MPB-NH2在10% D2O/ 30 %TFE-d3/ 60 %H2O水溶液中，溫度為310 K，pH 4.02的條件下之NOESY光譜圖，顯示Tyr9上2,6H及3,5H與其他胺基酸的NOE訊號。	99
圖4-26：9Y-MPB-NH2在283 K下各殘基與無序纏繞的αH的化學位移差值。 	103
圖4-27：9Y-MPB-NH2在310 K下各殘基與無序纏繞的αH的化學位移差值。 	104
圖4-28：9Y-MPB-NH2在283 K下各殘基與無序纏繞的αC的化學位移差值。 	105
圖4-29：9Y-MPB-NH2在310 K下各殘基與無序纏繞的αC的化學位移差值。 	106
圖4-30：9Y-MPB-NH2在283 K時，20個能量最小的結構疊圖。	108
圖4-31：9Y-MPB-NH2在283 K的絲帶結構圖，螺旋結構K4-V13。	108
圖4-32：9Y-MPB-NH2在310 K時，20個能量最小的結構疊圖。	109
圖4-33：9Y-MPB-NH2在310K的絲帶結構圖，螺旋結構S5-V13。	109
圖4-34：9Y-MPB-NH2在283 K Ramachandran plot圖，顯示雙面繳殘基多座落於右旋的α-helix上。	110
圖4-35：9Y-MPB-NH2在310 K Ramachandran plot圖，顯示雙面繳殘基多座落於右旋的α-helix上。	110
圖4-36：9Y-MPB-NH2自結合時產生之π-π interaction示意圖。	114
圖4-37：Ile6及Tyr9在9Y-MPB-NH2中以疏水作用力相互作用圖。	114
圖4-38：Tyr9及Val13在9Y-MPB-NH2中其兩者側鏈非常鄰近。	115
圖4-39：9Y-MPB-NH2自結合時之Ser5與Lys12以靜電作用力相互作用示意圖。  	115
圖4-40：9Y-MPB-NH2自結合時產生之π-π interaction示意圖。	116
圖4-41：9Y-MPB-NH2在NMR光譜上各別殘基的化學位移差值(283 K→310 K)，(A) NH chemical shift (B) αH chemical shift(C)βH chemical shift。	120
圖4-42：MPB-NH2與其類似物之胜肽濃度對E.coli 抑制生長率趨勢圖。	122
圖4-43：抗菌胜肽結構重要參數的相互關係。	123
圖4-44：左圖為利用Helical Wheel Projections 所預測的雙性結構投影圖以及其極性角度對照右圖為X-PLOR 計算出的α-helix 結構形成圖(A)MPB-NH2 (B) 9F-MPB-NH2(C) 9Y-MPB-NH2。	131
圖4-45：不同芳香環化合物之結構與靜電結合能力。	132
圖4-46：A) MPB-NH2 (B) 9Y-MPB-NH2為3D分子模型，白色區塊為Lys殘基，圓圈處表示芳香環殘基之疏水表面積大小。	133
 
表目錄
表1-1：MPB-NH2及其類似物活性比較。	6
表2-1：CD光譜胜肽二級結構的特定吸收波長。	19
表2-2：連續及非連續的NOE可預測產生特定的二級結構。	35
表2-3：20種常見胺基酸在無規捲曲下，Hα的化學位移範圍。	41
表2-4：20種常見胺基酸在無規捲曲下，NH的化學位移範圍。	42
表2-5：20種常見的胺基酸在無序纏捲下，αC、CO和βC的化學位移範圍。Gly沒有βC的化學位移範圍，13C的化學位移範圍即為CO的化學位移範圍。 	43
表3-1：合成時所使用活化、偶合和去保護的時間。	54
表3-2：純化9Y-MPB-NH2所使用的沖堤梯度參數。	55
表3-3：圓二色光譜儀的實驗參數。	59
表3-4：9Y-MPB-NH2時所設定參數。	60
表3-5：9Y-MPB-NH2弛緩實驗的參數設定條件。	61
表3-6：mfinput變數。	65
表4-1：9Y-MPB-NH2 以及MPB-NH2在不同溫度下的α-helix 含量。	68
表4-2：MPB-NH2經DOSY實驗的結果整理表。	74
表4-3：9F-MPB-NH2經DOSY實驗的結果整理表。	74
表4-4：9Y-MPB-NH2經DOSY實驗的結果整理表。	74
表4-5：濃度為5 mM的9Y-MPB-NH2在10 % D2O/ 30 %TFE-d3/ 60 %H2O水溶液中，溫度為283 K，pH 4.02條件下的1H的化學位移表。	86
表4-6：濃度為5 mM的9Y-MPB-NH2在10 % D2O/ 30 %TFE-d3/ 60 %H2O水溶液中，溫度為283 K，pH 4.02條件下的13C的化學位移表。	87
表4-7：9Y-MPB-NH2 283 K NOESY光譜的NOE訊號整理。	88
表4-8：濃度為5 mM的9Y-MPB-NH2在10 % D2O/ 30 %TFE-d3/ 60 %H2O水溶液中，溫度為310 K，pH 4.02條件下的1H的化學位移表。	100
表4-9：濃度為5 mM的9Y-MPB-NH2在10 % D2O/ 30 %TFE-d3/ 60 %H2O水溶液中，溫度為310 K，pH 4.02條件下的13C的化學位移表。	101
表4-10：9Y-MPB-NH2 310 K NOESY光譜的NOE訊號整理。	102
表4-11：9Y-MPB-NH2 283K , 310 K之全關聯時間(τm)與平均次序參數(S2)值。   	116
表4-12：9Y-MPB-NH2在283 K各殘基13Cα的T1、T2與NOE值。	117
表4-13：9Y-MPB-NH2在310 K各殘基13Cα的T1、T2與NOE值。	117
表4-14：9Y-MPB-NH2各殘基的S2值與NOE訊號數量總整理。	118
表4-15：9Y-MPB-NH2各殘基的S2值與NOE訊號數量總整理。	118
表4-16：MPB-NH2 及其類似物之抗菌活性比較。	121
表4-17：胺基酸之疏水性值。	126
表4-18：Guo建立的胺基酸之Retention Coefficients。	127
表4-19：MPB-NH2 及其類似物之極性角度比較。	130

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