Ⅰ 菸草鑲嵌病毒之甲基轉移酶表現、純化與活性探討
菸草鑲嵌病毒 (Tobacco mosaic virus) 是植物病毒最常見之一，其基因體所轉譯出大小約 126 kDa 的蛋白具有甲基轉移酶活性，近年來有許多研究皆著重於病毒的使宿主核酸甲基化，對於宿主蛋白質甲基化尚未有人研究。本研究利用大腸桿菌異源重組表現 his-tag 異源蛋白質，初期測試中，以降溫、添加界面活性劑等，經過許多次重新摺疊測試，均以不溶解的包涵體 (inclusion body) 存在。由文獻紀載 GST 融合蛋白促進蛋白質正確摺疊，因此以 pGEX4T-1 為載體，建構 pGEX4T-1-MT 成功表現可溶性蛋白質。將 GST 融合蛋白經由 GSH column 純化後與菸草粗蛋白和 Hot-SAM 反應。實驗結果顯示，在感染病毒之菸草比未感染菸草多出較明顯的受質訊號。因此以大腸桿菌異源表現 MT蛋白質可能具有活性且能讓宿主蛋白質甲基化。
Ⅱ 啤酒酵母菌 GPD1p 過度表現對粒線體形態的影響
先前的研究發現啤酒酵母菌 (Saccharomyces cerevisiae) 中 ADH3p 對粒線體形態所造成的影響，其原因為蛋白質活性影響 NADH/NAD+ 有關。由文獻指出 GPD1p 合成甘油過程中並將 NADH 氧化成 NAD+，因此本研究建構 pYes2-GPD1-GFP 轉殖入啤酒酵母菌中，觀察過度表現 GPD1p 是否影響粒線體形態。實驗結果顯示，誘導後 pYes2-GPD1-GFP 其 83% 粒線體呈現 fragmented 狀；未誘導 pYes2-GPD1-GFP 與 pYes2 的粒線體皆呈現 tubular 狀。測試將培養基中葡萄糖以甘油取代的條件下培養，其 pYes2-GPD1-GFP 與 pYes2 的粒線體皆呈現 fragmented 狀，結果表示粒線體形態改變會受 NADH/NAD+ 所影響。

PartⅠ
Tobacco mosaic virus is the most common virus in the plant. The genome of this virus can be translated to protein which contains methyltransferase activity. In the past, a lot of researches focused on the viral nucleic acid methylation of the host. The host protein methylation has not yet been studied. In this study, we used recombinant E. coli to express heterologous protein. At first, E. coli. expressed the his-tag protein with inclusion body. We tried a number of conditions, such as cooling or adding surfactants, but it still expressed the protein with inclusion body. Some studies have found that GST tag could help protein fold with correct form. Therefore, we used pGEX4T-1 as a carrier vector to construct pGEX4T-1-MT and finally expressed the protein present in the supernatant. We purified the GST fusion protein with GSH column and reacted with Hot-SAM and tobacco crude protein. Experimental results showed that it had more substrate signal in the infected plants than uninfected plants. Therefore, E. coli can express heterologous proteins with activity and may allow host protein methylation.
PartⅡ
Previous studies have found that ADH3 protein in Saccharomyces cerevisiae affects morphology of mitochondria. The putative reason is that ADH3 protein can influence NADH/NAD+ ratio. It has been shown that GPD1 protein could synthesize glycerol and oxidize NADH to NAD+. Therefore, we constructed pYes2-GPD1-GFP and transformed it to S. cerevisiae. Experimental results show that after we induced the construct gene, pYes2-GPD1-GFP, the mitochondrial morphology of S. cerevisiae appeared fragmented for 83 percent. With non-induced genes, pYes2-GPD1-GFP and pYes2, the mitochondrial morphology of S. cerevisiae appeared tubular. When we replaced the medium glucose to glycerol, we found that both constructs, pYes2-GPD1-GFP and pYes2, made mitochondrial morphology to patterns appear fragmented. The result showed that the morphology of mitochondria may be influenced by NADH/NAD+ ratio.

謝誌 Ⅰ
中文摘要 Ⅱ
英文摘要 Ⅲ
目錄 Ⅴ
表目錄 XI
圖目錄 XIII	
第一部份 菸草鑲嵌病毒之甲基轉移酶表現、純化與活性探討 1
第一章 緒論 1
1.1 研究動機 1
第二章 文獻回顧 2
2.1 菸草鑲嵌病毒之背景介紹 2
2.2 菸草鑲嵌病毒之前人研究 3
2.3 蛋白質甲基化 4
第三章 材料與方法 5
3.1 實驗流程 5
3.2 質體建構流程圖 6
3.3 實驗材料 6
3.3.1菌株 6
3.3.2 載體 7
3.3.3 引子 7
3.3.4 操作試液套件組 (Kit) 7 
3.3.5 標準分子量溶液 7 
3.3.6 酵素 7   
3.3.7 實驗藥品 8　
3.3.8 實驗儀器 9　
3.4 實驗方法 10　　　
3.5 質體建構 10　　
3.5.1 建構 pGEMR-T-MT 質體 10　
3.5.2 建構 pGEX4T-1-MT 質體 12
3.6 質體抽取 13
3.7 DNA純化法 14　
3.7.1 DNA Clean up 14　　　
3.7.2 DNA gel extraction 15　
3.8 基因轉殖法 16　　　　　
3.8.1 E. coli勝任細胞製備 16　　　
3.8.2 E. coli熱休克法 17　　　　　
3.9 於大腸桿菌中誘導病毒蛋白表現 17
3.10 超音波破菌 18　　
3.11 蛋白質膠體電泳 18　
3.12 GST-tag 純化重組蛋白 19　
3.13 質譜儀分析 20　　　　　
3.14 植物全蛋白質之粗萃取 21　
3.15 甲基化活性 21　　　
第四章 結果與討論 23
4.1 質體建構 23　　　　　
4.1.1 建構 pGEMR-T-MT 質體 23
4.1.2 建構 pGEX4T-1-MT 質體 26
4.2 誘導 E. coli BL21 (DE3) 之 MT 蛋白質表現 28
4.3 MT 蛋白質純化 30
4.4 甲基化活性 32　　
第五章 結論 33
第二部份 啤酒酵母菌 GPD1p 過度表現對粒線體形態的影響 34
第一章 緒論 34
1.1 研究動機 34
第二章 文獻回顧 35　
2.1 啤酒酵母菌 35
2.2 甘油-3-磷酸脫氫酶介紹 35
2.3 粒線體之構造 36　
2.4 粒線體之生物功能 36
第三章 材料與方法 39
3.1 實驗流程 39　
3.2 質體建構流程圖 39
3.3 實驗材料　40
3.3.1 菌株 40
3.3.2 載體 40　
3.3.3 引子 40　　
3.3.4 操作試液套件組 (Kit) 41
3.3.5 標準分子量溶液 41
3.3.6 酵素 41
3.3.7 實驗藥品 42
3.3.8 實驗儀器 43
3.4 實驗方法 43　
3.4.1 抽取酵母菌 genomic DNA 43
3.5 質體建構 44
3.5.1 建構 pGEMR-T-GPD1 質體 44
3.5.2 建構 pGEMR-T-GFP 質體 46
3.5.3 建構 pYes2-GPD1-GFP 質體 48
3.5.4 建構 pYes2-GPD1K245T-GFP 質體 49　　
3.6 基因轉殖法 49
3.6.1 S. cerevisiae 勝任細胞製備 49
3.6.2 S. cerevisiae 熱休克法 50　
3.7 於啤酒酵母菌中誘導目標蛋白表現 51
3.8 酵母菌全蛋白質之粗萃取 52
3.9 粒線體染色觀察變化 52　
第四章 結果與討論 54　
4.1 質體建構 54
4.1.1 建構 pGEMR-T-GPD1 質體 54
4.1.2 建構 pGEMR-T-GFP 質體 57
4.1.3 建構 pYes2-GPD1-GFP 質體 59
4.2 誘導 S. cerevisiae BJ2168 之GPD1-GFP 蛋白質表現 61
4.3 粒線體形態變化 63
4.3.1 過度表現觀察粒線體染色形態變化 63
4.3.2 以 YPG 培養基培養觀察粒線體形態變化65
第五章 結論 69
參考文獻 70　

表目錄
第一部份 菸草鑲嵌病毒之甲基轉移酶表現、純化與活性探討
表 3.1 PCR反應條件  11
表 3.2 A-tailing 反應條件  11
表 3.3 pGEMR -T vector 與 MT 酶接反應  12
表 3.4 pGEMR -T-MT 質體以限制酶反應  13
表 3.5 pGEX4T-1 質體以限制酶反應  13
表 3.6 pGEX4T-1 與 MT 酶接反應  13
表 3.7 TFBⅠ buffer、TFBⅡ buffer 組成  16
表 3.8 LB medium、LB plate 組成  17
表 3.9 SDS-PAGE 的製備  19
表 3.10 PBS buffer 組成 21
表 3.11 甲基化反應條件  22
第二部份 啤酒酵母菌 GPD1p 過度表現對粒線體形態的影響
表 3.1 GPD1 之 PCR 反應條件  45
表 3.2 pGEMR -T vector 與 GPD1 酶接反應  45
表 3.3 pGEMR -T-GPD1 質體以限制酶反應  46
表 3.4 GFP 之 PCR 反應條件  47
表 3.5 pGEMR -T vector 與 GFP 酶接反應  47
表 3.6 pGEMR -T-GFP 質體以限制酶反應  47
表 3.7 pYes2 質體以限制酶反應  48
表 3.8 pYes2 vector 與 GPD1、GFP 酶接反應  48
表 3.9 pYes2-GPD1K245T-GFP 之點突變反應條件  49
表 3.10 TE/LiOAc/DTT buffer 組成  50
表 3.11 PTLAD buffer 組成  51

圖目錄
第一部份 菸草鑲嵌病毒之甲基轉移酶表現、純化與活性探討
圖 2.1 未感染 TMV 病毒之菸草；感染 TMV 病毒之菸草  2
圖 2.2 TMV 基因體及轉譯出蛋白質  4
圖 3.1 實驗架構圖  5
圖 3.2 pGEX4T-1-MT 質體建構流程  6
圖 4.1 pGEMR -T-MT DNA 電泳分析  24
圖 4.2 MT 核酸定序  25
圖 4.3 pGEX4T-1-MT DNA 電泳分析  26
圖 4.4 pGEX4T-1-MT 蛋白質分析  29
圖 4.5 GST-tag 純化蛋白質分析  30
圖 4.6 MALDI-TOF MS 分析  31
圖 4.7 甲基化活性  32
第二部份 啤酒酵母菌 GPD1p 過度表現對粒線體形態的影響
圖 2.1 啤酒酵母菌之甘油代謝中涉及的路徑和基因  36
圖 2.2 粒線體之電子傳遞鏈  38
圖 3.1 pYes2-GPD1-GFP 質體建構流程  39
圖 4.1 pGEMR -T-GPD1 DNA 電泳分析  55
圖 4.2 GPD1 核酸定序  56
圖 4.3 pGEMR -T-GFP DNA 電泳分析  58
圖 4.4 GFP 核酸定序 。。 58
圖 4.5 pYes2-GPD1-GFP DNA 電泳分析  60
圖 4.6 GPD1-GFP 蛋白質分析  61
圖 4.7 粒線體形態統計歸納  64
圖 4.8 過度表現 pYes2-GPD1-GFP 後粒線體形態  65
圖 4.9 過度表現 pYes2 後粒線體形態  65
圖 4.10 以 YPG 培養 pYes2-GPD1-GFP、pYes2 粒線體形態統計歸
納  66
圖 4.11 以 YPG 培養 pYes2-GPD1-GFP、pYes2 粒線體形態 67
圖 4.12 以 YPG 培養並誘導 pYes2-GPD1-GFP、pYes2 粒線體形態
統計歸納  67
圖 4.13 以 YPG 培養並誘導 pYes2-GPD1-GFP、pYes2 粒線體形
態  68

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