幾丁聚醣經化學(過硫酸鈉)或酵素(胃蛋白酶)降解的主要產物是低分子量幾丁聚醣和幾丁寡醣(COS)，本論文分別以毛細管區帶電泳(CZE)和毛細管膠體電泳(CGE)分析低分子量幾丁聚醣產物的去乙醯化程度(DDA)和分子量相關電泳遷移率。而COS產物的組成和平均DDA則以高效能液相層析儀(HPLC)與基質輔助雷射脫附游離飛行時間質譜儀(MALDI-TOF/MS)分析。我們的分析方法具有快速檢測和微量分析的特性，有利於探討幾丁聚醣降解之反應性。
以CZE在鹼性(pH 9.35)與酸性(pH 2.00)電泳緩衝溶液下進行降解空白實驗之分析，經實驗結果得知，在分離純化降解產物時，胃蛋白酶會殘留於COS產物中。但因反應所使用的胃蛋白酶的濃度很低，且其具有較大分子量，所以幾乎不影響COS產物於CZE和MALDI-TOF/MS之分析。
此外，我們探討以NH MB100 40/75 μm Silica Gel作為吸附劑，應用於COS產物之純化和除鹽。經由CZE與MALDI-TOF/MS的分析，可獲得最佳吸附劑使用量。我們以酸性溶液(0.1% TFA)活化吸附劑，使其胺基(-NH2)質子化而具較強正電性，可排斥具正電性的幾丁寡醣分子，並吸附鹽類陰離子。此純化方式可以達到除鹽的效果，不會有明顯的樣品流失，因此有利於樣品之偵測和分析。
最後，利用HPLC初步純化COS產物，以MALDI-TOF/MS鑑定經HPLC分離回收COS之組成，比對原始COS產物與HPLC分離的COS分子之CZE析出時間以標示電泳吸收峰之組成。目前我們已經在CZE電泳圖上標示出產量較高的主要COS產物之組成。建構此完整的高解析度COS-CZE電泳圖，會更進一步提升幾丁聚醣降解所得幾丁寡醣產物之定性和定量分析之效率。

The major products of chitosan degraded by chemical (sodium persulfate, NaPS) or enzyme (pepsin) are low molecular weight chitosan (low Mw chitosan) and chitooligosaccharide (COS). In this thesis we utilized capillary zone electrophoresis (CZE) and capillary gel electrophoresis (CGE) to analyze the degree of deacetylation (DDA) and the molecular weight related electrophoretic mobility of the low Mw chitosan product. Moreover, the composition and average DDA of the COS product were determined by high performance liquid chromatography (HPLC) and matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/MS). Our analytical method features fast measurement and microanalysis, and thus is advantageous to the study of degradation reactivity of chitosan.
According to the basic (pH 9.35) and acidic (pH 2.00) CZE results obtained from the blank experiment of chitosan degradation reaction, pepsin was found left in the COS after the separation and purification process of degradation products. However, the CZE and MALDI-TOF/MS analyses of the COS product will not be affected due to the low concentration and high molecular weight of pepsin.
Furthermore, we investigated the application of NH MB100 40/75 μm Silica Gel as the adsorbent to purify and desalt the COS product. Through CZE and MALDI-TOF/MS analyses, the optimal amount of adsorbent was determined. An acidic aqueous solution (0.1% TFA) was used to activate the adsorbent by protonating the amine functional group, generating positively charged sites to repel the cationic COS and attract the salt anions. This purification method can achieve desalting without significant sample loss, and thus facilitates the sample detection and analysis.
Lastly, the COS product was preliminarily purified by HPLC, and the compositions of the HPLC separated and recovered COS molecules were determined by MALDI-TOF/MS. The CZE elution times of the original COS product and that of the HPLC separated COS molecules were compared to assign the peak compositions of the CZE electropherogram. Currently we have identified the compositions of the major peaks of the electropherogram for the original COS product. The construction of the complete high resolution COS-CZE electropherogram can further enhance the efficiency of the qualitative and quantitative analysis of COS product obtained from chitosan degradation reaction.

總目錄
中文摘要	I
英文摘要	II
總目錄	IV
圖目錄	VIII
表目錄	XVII
簡寫表	XVIII
第一章、緒論	1
1.1前言	1
1.2研究動機	2
1.3幾丁質、幾丁聚醣簡介	3
1.4幾丁聚醣之降解反應	4
1.4.1酵素降解	4
1.4.2化學降解	5
1.5毛細管電泳簡介	7
1.5.1毛細管電泳介紹	7
1.5.2毛細管電泳原理	7
1.5.3電泳遷移率(Electrophoretic mobility)	8
1.5.4電滲透流 (Electroosmotic flow, EOF)	8
1.5.5毛細管電泳的分離方法	10
1.5.6樣品注入方式	11
1.6 MALDI-TOF/MS簡介	12
1.7 測量幾丁聚醣降解產物之去乙醯化程度與分子量	16
1.7.1 利用毛細管電泳分析幾丁聚醣	16
1.7.2 利用MALDI-TOF/MS測量幾丁寡醣之去乙醯化程度	18
1.7.3 利用核磁共振法測量幾丁聚醣之去乙醯化程度	18
1.7.4 利用黏度計測量幾丁聚醣的平均黏度分子量 (Mv)	20
1.8 利用高效能液相層析儀分離幾丁寡醣	21
1.9 本章參考文獻	27
第二章、實驗	34
2.1 實驗藥品與器材	34
2.2 實驗儀器	41
2.3 實驗方法與步驟	44
2.3.1 毛細管處理	44
2.3.2 毛細管電泳緩衝溶液的配置	46
2.3.3 以毛細管電泳測量幾丁聚醣去乙醯化程度之條件與步驟	47
2.3.4 利用毛細管膠體電泳測定幾丁聚醣電泳遷移率	49
2.3.5 利用毛細管電泳測定幾丁聚醣極限黏度分子量	51
2.3.6 利用毛細管電泳測定胃蛋白酶	54
2.3.7 利用核磁共振法測量幾丁聚醣之去乙醯化程度	55
2.3.8 利用MALDI-TOF/MS 分析幾丁寡醣樣品	56
2.3.9 利用高效能液相層析儀分離純化幾丁寡醣樣品	60
2.4 實驗樣品製備	62
2.4.1 幾丁聚醣的乙醯化反應	62
2.4.2 幾丁聚醣的去乙醯化反應	63
2.4.3 幾丁聚醣的降解反應	63
2.4.4 以Silica Gel 純化化學降解幾丁聚醣所得幾丁寡醣	66
2.5 本章參考文獻	68
第三章 結果與討論	70
3.1 幾丁聚醣之酵素降解與化學降解	70
3.1.1 Pepsin殘留於幾丁寡醣產物之分析	70
3.1.2 以 Pepsin 降解幾丁聚醣所得低分子量幾丁聚醣產物之分析	77
3.1.3 以 Pepsin 降解 DDA 35% 幾丁聚醣所得幾丁寡醣產物之分析	81
3.2 利用Silica gel純化降解幾丁聚醣所得幾丁寡醣	89
3.2.1 酵素降解 COS 產物與化學降解 COS 產物混合樣品之分析	89
3.2.2 酵素降解 COS 產物溶於化學降解反應液樣品之分析	106
3.2.3 NH 固定相所衍生雜質對 CE和 MALDI 分析的影響	113
3.2.4 以 Pepsin 降解幾丁聚醣所得幾丁寡醣產物於高度鹽類環境分析	122
3.3 幾丁寡醣在 HPLC 中的分離	127
3.3.1 以 Amide group 管柱分離幾丁寡醣之樣品訊號	127
3.3.2 以 Amino group 管柱分離幾丁寡醣之樣品訊號	136
3.3.3 鑑定 COS 混合樣品之 CE 圖譜吸收峰的寡醣組成	142
3.4 本章參考文獻	159
第四章 結論	160

 
圖目錄
圖1-1、幾丁質與幾丁聚醣化學結構式	3
圖1-2、幾丁聚醣經過硫酸根離子降解之反應機構	6
圖1-3、毛細管內壁及電滲透流生成示意圖	9
圖1-4、流體動力的拋物線流及毛細管電泳的平板流	10
圖1-5、MALDI-TOF/MS實驗示意圖	12
圖1-6、飛行時間質析 (TOF) 示意圖	14
圖1-7、直線型 (Linear Mode) MALDI-TOF/MS與反射型 (Reflector Mode) MALDI-TOF /MS示意圖	15
圖1-8、由14種幾丁聚醣標準品所建立之電泳遷移率對去乙醯化程度 (NMR測量結果) 的校正曲線	17
圖1-9、幾丁聚醣的NMR光譜中，各訊號與其在分子結構上相對應位置的氫原子	19
圖2-1、LMW-S 黏度對濃度關係圖	53
圖2-2、幾丁聚醣 NMR氫譜中各個H化學位移訊號及其在分子上的位置	56
圖2-3、LMW-S-reA0.8 (DDA 35% ) 經 pepsin降解 72 小時所得 COS 之 MS 圖譜	58
圖 3-1、Pepsin 經樣品分離純化步驟前後 CZE 分析樣品之毛細管電泳圖	73
圖 3-2、Pepsin 經樣品分離純化步驟前後 CZE 分析樣品之毛細管電泳圖	74
圖 3-3、Pepsin 經樣品分離純化步驟前後 CZE 分析樣品之毛細管電泳圖	75
圖 3-4、(a) LMW-S-reA0.8 ( DDA35% 幾丁聚醣) 經 pepsin 降解 72 小時後所得 COS 樣品之毛細管電泳圖。(b) 和 (c) 為空白實驗電泳圖	76
圖 3-5、(1) LMW-S-reA0.8 (DDA35% 幾丁聚醣) 經 pepsin降解 1~ 72 小時後所得 Low Mw chitosan 產物之毛細管電泳圖 (CZE)；(2) 降解 72小時所得寡醣產物電泳圖	79
圖 3-6、(1) LMW-S-reA0.8 (DDA35% 幾丁聚醣) 經 pepsin降解 1 ~ 72 小時後所得 Low Mw chitosan 產物之毛細管膠體電泳圖；(2) 降解 72小時所得寡醣產物電泳圖	80
圖 3-7、LMW-S-reA0.8 (DDA35% 幾丁聚醣) 經 pepsin降解 1 ~ 72 小時後所得 COS 產物之毛細管電泳圖	83
圖 3-8、LMW-S-reA0.8 (DDA35% 幾丁聚醣) 經 pepsin降解 1 ~ 72 小時後所得 COS 產物之毛細管膠體電泳圖	84
圖 3-9 (1)、LMW-S-reA0.8( DDA35% 幾丁聚醣) 經 pepsin降解 1 ~ 72 小時後所得 COS 產物之 MALDI-TOF/MS 質譜圖	85
圖 3-9 (2)、前圖中 (a) ~ (d) 訊號放大圖	86
圖 3-10、以不同克數 NH MB100 固定相進行純化酵素降解及化學降解寡醣產物比為1：1 樣品，再以 CE 分析所得之電泳圖	95
圖 3-11、以不同溶劑活化 NH MB100 固定相，進行純化酵素降解及化學降解寡醣產物比為1：1 樣品，再以 CE 分析所得之電泳圖	96
圖 3-12、以不同濃度 TFA 活化不同克數之 NH 固定相，進行純化酵素降解及化學降解寡醣產物比為1：1 樣品，再以 CE 分析所得之電泳圖	97
圖 3-13、以 COOH 固定相 (25 mg)，進行純化酵素降解及化學降解寡醣產物比為 1：1 樣品，再以 CE 分析殘留與脫附樣品所得毛細管電泳圖	98
圖 3-14、以不同克數 NH MB100 固定相進行純化酵素降解及化學降解寡醣產物比為 1：1 樣品，再以 MALDI-TOF/MS 分析所得之質譜圖	99
圖 3-15、以不同溶劑活化 NH MB100 固定相，進行純化酵素降解及化學降解寡醣產物比為1：1 樣品，再以 MALDI-TOF/MS 分析所得之質譜圖	100
圖 3-16、以不同濃度 TFA 活化 NH MB100 固定相或不同克數之固定相，進行純化酵素降解及化學降解寡醣產物比為1：1 樣品，再以 MALDI-TOF/MS 分析所得之質譜圖	101
圖 3-17、以不同克數 NH MB100 固定相進行純化酵素降解及化學降解寡醣產物比為 1：1 樣品之MALDI 樣品結晶圖	102
圖 3-18、以不同溶劑活化 NH MB100 固定相，進行純化酵素降解及化學降解寡醣產物比為 1：1 樣品之 MALDI 樣品結晶圖	102
圖 3-19、以不同濃度 TFA 活化 NH MB100 固定相或不同克數之固定相，進行純化酵素降解及化學降解寡醣產物比為1：1 樣品之 MALDI 樣品結晶圖	103
圖 3-20、以 NH MB100 (25mg) 固定相進行純化 LMW-S-reA0.4-pepsin 3 hr 幾丁寡醣樣品，再以 CE 分析所得之毛細管電泳圖	108
圖 3-21、以 NH MB100 (25mg) 固定相進行純化 LMW-S-reA0.4-pepsin 72 hr 幾丁寡醣樣品，再以 CE 分析所得之毛細管電泳圖	109
圖 3-22、(a) LMW-S-reA0.4-pepsin 3 hr-COS、(b) 未經 NH 固定相的 LMW-S-reA0.4-pepsin 3 hr-COS+LMW-S-De-NaPS 3hr 樣品、(c) 未經 NH 固定相的 LMW-S-reA0.4-pepsin 3 hr-COS+Blank-NaPS 3hr 樣品，以及經固定相純化樣品分別為 (d) 和 (e) 所測得之 MALDI/TOF MS 質譜圖	110
圖 3-23、(a) LMW-S-reA0.4-pepsin 72 hr-COS、(b) 未經 NH 固定相的 LMW-S-reA0.4-pepsin 72 hr-COS+LMW-S-De-NaPS 3hr 樣品、(c) 未經 NH 固定相的 LMW-S-reA0.4-pepsin 72 hr-COS+Blank-NaPS 3hr 樣品，以及經固定相純化樣品分別為 (d) 和 (e) 所測得之 MALDI/TOF MS 質譜圖	111
圖 3-24、酵素降解 3 hr 及化學降解寡醣產物比為1：1 或產物比為1：0 樣品之 MALDI 樣品結晶圖	112
圖 3-25、酵素降解 72 hr 及化學降解寡醣產物比為1：1 或產物比為1：0 樣品之 MALDI 樣品結晶圖	112
圖 3-26、以 0.1% 或 0.5% TFA 活化 NH MB100 (25 mg) 固定相，進行純化 LMW-S-reA0.4-pepsin 72hr-COS 和 DDW，再以 CE 分析所得毛細管電泳圖	115
圖 3-27、以 0.1% 或 0.5% TFA 活化 NH MB100 (25 mg) 固定相，進行純化 LMW-S-reA0.8-pepsin 72hr-COS 和 DDW，再以 CE 分析所得毛細管電泳圖	116
圖 3-28、LMW-S-reA0.4 (DDA35% 幾丁聚醣) 以 pepsin 降解 72 小時後所得幾丁寡醣樣品，經 NH 固定相 (25 mg) 純化後之 MALDI-TOF/MS 質譜圖	117
圖 3-29、LMW-S-reA0.8( DDA35% 幾丁聚醣) 以 pepsin 降解 72 小時後所得幾丁寡醣樣品，經 NH 固定相 (25 mg) 純化後之 MALDI-TOF/MS 質譜圖	118
圖 3-30、以 DDW 或 0.1% TFA活化 NH MB100 固定相 (25 mg)，純化含高鹽類的 LMW-S-reA0.4-pepsin 72hr-COS，再以 CE 分析所得之毛細管電泳圖	124
圖 3-31、(a) LMW-S-reA0.4-pepsin 72 hr-COS、(b) 未經 NH 固定相的 LMW-S-reA0.4-pepsin 72 hr-COS (五份鹽類)，經 NH 固定相純化樣品分別為 (c) 與 (d) 所測得之 MALDI/TOF MS 質譜圖	125
圖 3-32、高鹽類幾丁寡醣除鹽前與除鹽後之 MALDI 樣品之結晶圖	126
圖3-33、LMW-S-reA0.8 (DDA35% 幾丁聚醣) 經酵素 (pepsin) 降解 72 小時後所得 COS 樣品與酵素降解空白實驗層析圖譜之比較	130
圖3-34、酵素 (pepsin) 降解反應所使用的緩衝溶液於不同處理方式之層析圖譜	131
圖3-35、LMW-S-reA0.8 (DDA35% 幾丁聚醣) 經酵素 (pepsin) 降解 72 小時後所得 COS 樣品於不同移動相之層析圖譜	132
圖3-36、LMW-S-reA0.8 (DDA35% 幾丁聚醣) 經酵素 (pepsin) 降解 72 小時後所得 COS 樣品於不同移動相流速的層析圖譜	133
圖3-37、LMW-S-reA0.8 (DDA35% 幾丁聚醣) 經酵素 (pepsin) 降解 72 小時後所得 COS 樣品有無經過 NH 固定相純化之層析圖譜與毛細管電泳圖	134
圖3-38、LMW-S-reA0.8 (DDA35% 幾丁聚醣) 經酵素 (pepsin) 降解 72 小時後所得 COS 樣品之層析圖譜與毛細管電泳圖	135
圖3-39、LMW-S-reA0.8(DDA35% 幾丁聚醣)經酵素 (pepsin) 降解 72 hr 後所得 COS 樣品、酵素降解空白實驗，與製備 COS 所用試劑的層析圖譜之比較	138
圖3-40、LMW-S-reA0.8(DDA35% 幾丁聚醣)經酵素 (pepsin) 降解 72 hr 後所得 COS 樣品於不同有機溶劑比例的分離效果之層析圖譜	139
圖3-41、LMW-S-reA0.8(DDA35% 幾丁聚醣)經酵素 (pepsin) 降解 72 hr 後所得 COS 樣品與單體 1A 和 1D 之層析圖譜	140
圖3-42、LMW-S-reA0.8(DDA35% 幾丁聚醣)經酵素 (pepsin) 降解 72 hr 後所得 COS 樣品與單體 1A 和 1D之層析圖譜	141
圖3-43、LMW-S-reA0.8 (DDA35% 幾丁聚醣) 經酵素 (pepsin) 降解 72 小時後所得 COS 樣品之層析圖譜	144
圖3-44 (1)、經 HPLC 分離回收之 COS 樣品之毛細管電泳圖	145
圖3-44 (2)、經 HPLC 分離回收之 COS 樣品之毛細管電泳圖	146
圖3-45 (1)、LMW-S-reA0.8 (DDA35% 幾丁聚醣) 經酵素 (pepsin) 降解 72 小時後所得 COS 樣品，經 HPLC 分離回收，再經 MALDI-TOF/MS 分析所得質譜圖	147
圖3-45 (2)、LMW-S-reA0.8 (DDA35% 幾丁聚醣) 經酵素 (pepsin) 降解 72 小時後所得 COS 樣品，經 HPLC 分離回收，再經 MALDI-TOF/MS 分析所得質譜圖	148
圖3-46、LMW-S-reA0.8 (DDA35% 幾丁聚醣) 經酵素 (pepsin) 降解 72 小時後所得 COS 樣品之層析圖譜	151
圖3-47 (1)、經 HPLC 分離回收之 COS 樣品之毛細管電泳圖	152
圖3-47 (2)、經 HPLC 分離回收之 COS 樣品之毛細管電泳圖	153
圖3-48 (1)、LMW-S-reA0.8 (DDA35% 幾丁聚醣) 經酵素 (pepsin) 降解 72 小時後所得 COS 樣品，經 HPLC 分離回收，再經 MALDI-TOF/MS 分析所得質譜圖	154
圖3-48 (2)、LMW-S-reA0.8 (DDA35% 幾丁聚醣) 經酵素 (pepsin) 降解 72 小時後所得 COS 樣品，經 HPLC 分離回收，再經 MALDI-TOF/MS 分析所得質譜圖	155
圖3-49、LMW-S-reA0.8 (DDA35% 幾丁聚醣)經酵素 (pepsin) 降解 72 小時後所得 COS 樣品 (1 mg/mL*) 之毛細管電泳圖	158

 
表目錄
表1-1、常用基質整理表	13
表1-2、以HPLC胺基修飾管柱分析幾丁寡醣的相關論文整理	22
表2-1、LMW-S 各項黏度值	53
表2-2、LMW-S-reA0.8 (DDA 35% ) 經 pepsin降解 72 小時所得 COS 之 MALDI-TOF/MS 訊號	59
表2-3、各種酵素降解幾丁聚醣之反應條件	66
表3-1、LMW-S-reA0.8 ( DDA35% 幾丁聚醣) 經 pepsin降解 1 ~ 72 小時後所得 COS 產物之 MALDI/TOF MS 圖譜 (圖3-9) 訊號強度及寡醣組成	87
表3-2、以不同溶劑活化 NH MB100 固定相，進行純化酵素降解及化學降解寡醣產物比為1：1 樣品，再以 MALDI-TOF/MS 分析所得圖譜 (圖 3-15) 之訊號整理表	104
表3-3、圖 3-28與圖 3-29 MALDI-TOF/MS 圖譜之數據整理表	119
表3-4、利用 MALDI-TOF/MS 分析經 HPLC 分離回收的 COS 樣品之訊號整理表	149
表3-5、利用 MALDI-TOF/MS 分析經 HPLC 分離回收的 COS 樣品之訊號整理表	156

1.9 本章參考文獻
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