Part 1：使用原子力顯微術針對黏質沙雷氏菌之野生株與rssC基因突變株做表面的量測驗證。此外，利用溶菌酶處理前後的野生、突變株，亦可在量測後得到其個別的表面微結構相關參數，諸如：峰頂至基底高、平均高、表面粗糙度與根均方高度等等。上述數據經統計比較後發現，突變株的表面構造比野生株較為粗糙且陡峭。除此之外，經溶菌酶處理後的野生株其表面型態無明顯變化。先前的研究指出，rssC基因主要作用在菌外層膜之脂肪酸的生合成，rssC基因突變會造成菌外層膜的缺陷。本論文直接藉由觀察菌外層膜之結構變化，成功區分出突變株與野生株種，未來更可以將AFM延伸應用到它種細菌表面蛋白的基因表現。
Part 2：使用原子力顯微術量測A型流感病毒(H1N1)的表面奈米結構。根據病毒崩針對H1N1的病毒感染抑制效應之實驗結果，我們得到病毒崩可以在30~300ppm的濃度下對H1N1產生感染抑制的效果，而且須到達1000ppm濃度以上才會對狗腎細胞產生細胞毒性。所以利用300ppm的病毒崩，針對H1N1進行作用，再利用AFM做病毒粒子表面微結構與表面力學量測分析，量測後得到的表面微結構相關參數經統計比較後發現，H1N1的表面高度陡降(~90%↓)，其表面力學性質，如黏滯力、硬度等，皆呈現下降趨勢。未來AFM可以較有效率的方式應用於抗病毒藥物的研究與開發。
Part 3：先藉由聚合酶鏈鎖反應與西方點墨法確認帶有人類乳突病毒16型之患者檢體，再輔以AFM進行病毒粒子表面微結構與專一性抗體抗原作用力暨軟硬度分析。經純化後所得的人類乳突病毒粒子，以原子利顯微鏡量測後其大小約為50~55nm，此結果與電子顯微鏡相符合。實驗結果發現正常人與HPV患者間，兩者的專一性作用力與軟硬度分布，經統計處理後的高斯分布曲線可以完全分離不重疊。本研究的價值在於直接以HPV患者的檢體作為分析對象，實驗證實與非患者間可以做出有效鑑別。未來的研究可將AFM的應用推展到子宮頸癌臨床診斷上。

Part 1：Atomic force microscopy (AFM) has been used to identify the surfaces of intact S. marcescens wild-type CH-1 cells and rssC mutant CH-1∆C cells. CH-1 and CH-1∆C cells were observed before and after treatment with lysozyme, and their topography-related parameters, e.g., a valley-to-peak distance, mean height, surface roughness, and surface root-mean-square values were defined and compared. The data obtained suggest that the cellular surface topography of mutant CH-1∆C becomes rougher and more precipitous than that of wild-type CH-1 cells. Moreover, it was found that, compared with native wild-type CH-1, the cellular surface topography of lysozyme-treated CH-1 was not changed profoundly. The rssC gene is thus predicted to be mainly responsible for fatty-acid biosynthesis of the S. marcescens outer membrane, and the cell membrane aberrance sites are assumed to be located in the lipid. This study represents the first direct observation of the structural changes in membranes of bacterial mutant cells and offers a new prospect for predicting gene expression in bacterial cells.
Part 2：AFM has been used to probe the surface nanostructures of influenza viruses type A (H1N1). And according to inhibitory effects by VirusBom in H1N1 infection, we got that VirusBom could inhibit the native H1N1 infection in the concentration between 30~300 ppm, and it would be cytotoxicity to the madin-darby canine kidney (MDCK) cell if the concentration exceed 1000 ppm. H1N1 virions were observed before and after treatment with VirusBom by AFM, and their topography-related parameters and mechanical properties were defined and compared. Profiles displayed the height of H1N1 virions was from 56.66 ± 6.98 nm to 5.85 ± 0.83 nm (~90%↓) after treatment with 300ppm VirusBom, and the mechanical properties such as adhesion forces and stiffness values were also reduced. This new approach could be a useful technique for further investigating the antiviral drugs.
Part 3：We identified oncogenic HPV type-16 virions by PCR analysis and Western blotting from specimen of normal (C2) and HPV patient (E12). And then we used an AFM to probe the surface ultrastructure and to measure their unbinding force and stiffness. The size of isolated single HPV virion was similar it’s SEM image (~50nm), and the histograms of unbinding forces were wider for the HPV patient than for the normal. The corresponding mean unbinding forces, obtained by fitting of the histogram to a Gaussian function, were 312.7±99.9 pN, and 53.7±24.6 pN at pulling velocities of 333.3 nm/s respectively. These novel findings showed the detailed surface mechanical properties, including stiffness and unbinding forces of HPV type-16 virions, which are essential to their infection potential and virulence. This new approach could be a useful technique for further investigating the potential role among subtypes of HPVs in the oncogenesis of human cervical cancer.

目   錄
封   面  I
致   謝  II
摘   要  III
目   錄	VII
圖 目 錄	XI
表 目 錄	XV

Part 1：Unraveling the role of the rssC gene of Serratia marcescens by atomic force microscopy.	1

第一章	序論：	1
1-1	前言	1
1-2	文獻回顧   	3
1-3	粘質沙雷氏菌介紹    	4
1-4	革蘭氏陽性菌暨陰性菌簡介	7
1-5	原子力顯微術簡介	9
1-6	原子力顯微術操作模式	12
1-7	原子力顯微術之表面微結構參數(Parameters of surface topographies for AFM)	15
1-8	生物固定化技術	17
1-9	變異數分析法(Analysis of Variance, ANOVA)   	20
1-10	研究背景與動機	21

第二章	實驗部分：	22
2-1	細菌於雲母片上固定化技術	22
2-2	藥品與儀器	23
2-2-1 藥品部分	23
2-2-2 儀器部分	24
2-3	藥品製備	25
2-4	運用原子力顯微術量測細菌(野生株&突變株)表面微結構之實驗步驟	25
2-5	運用原子力顯微術量測經溶菌酶作用後的細菌(野生株&突變株)表面微結構之實驗步驟	26

第三章	實驗結果與討論：	27
3-1	菌體表面奈米微結構分析	27
3-1-1	野生株(CH-1)菌體表面奈米微結構分析	27
3-1-2	突變株(CH-1△C)菌體表面奈米微結構分析	29
3-1-3	經溶菌酶處理後之野生株菌體表面奈米微結構分析	30
3-1-4	經溶菌酶處理後之突變株菌體表面奈米微結構分析	31
3-2	rssC基因缺陷的作用機轉	32
3-3	野生株與突變株經溶菌酶作用前後之表面微結構的差異探討	33

第四章	結論	36

Part 2：Studies of surface ultrastructure and mechanical property of influenza A virus (H1N1) virions were treated with VirusBom by atomic force microscopy.	38

第一章	序 論：	38
1-1	前言	38
1-2	文獻回顧 	39
1-3	A型流感病毒(H1N1)介紹  	40
1-4	抗病毒化合物	45
1-5	原子力顯微術之力-距離曲線 	48
1-6	研究背景與動機	50

第二章	實驗部分：	51
2-1	病毒粒子於雲母片上固定化技術	51
2-2	藥品與儀器	52
2-2-1 藥品部分	52
2-2-2 儀器部分	53
2-3	藥品製備	54
2-4	運用原子力顯微術量測病毒粒子表面微結構之實驗步驟	54
2-5	運用原子力顯微術量測病毒粒子表面力學性質之實驗步驟	55
2-5-1懸臂樑探針選用與彈性係數校正	55
2-5-2比例常數(Sensitivity)校正	58
2-5-3 流感病毒粒子表面力學性質量測	59

第三章	實驗結果與討論：	60
3-1	經病毒崩作用前後之H1N1的病毒感染抑制效應(Inhibitory effects by VirusBom in H1N1 infection)	60
3-2	經病毒崩作用前後的病毒顆粒之表面奈米微結構分析	63
3-2-1未經病毒崩處理的病毒顆粒表面奈米微結構分析	63
3-2-2以30ppm病毒崩處理後的病毒顆粒表面奈米微結構分析	65
3-2-3以300ppm病毒崩處理後的病毒顆粒表面奈米微結構分析	68
3-2-4以蛋白水解酶(Protease K)處理後的病毒顆粒表面奈米微結構分析	71
3-2-5以Virusbom與Protease K作用前後之表面微結構的差異探討	74
3-3	經病毒崩作用前後的病毒顆粒之表面力學量測分析	76
3-3-1未經病毒崩處理的病毒顆粒之表面力學量測分析	76
3-3-2以30ppm病毒崩處理後的病毒顆粒之表面力學量測分析	77
3-3-3以300ppm病毒崩處理後的病毒顆粒之表面力學量測分析	78
3-3-4經病毒崩作用前後的病毒顆粒之表面力學量測分析	79

第四章	結論	80

Part 3：Novel atomic force microscopy revelations of oncogenic human papilloma virus (HPV) surface ultrastructure and mechanical property.	83

第一章	序論：	83
1-1	前言	83
1-2	文獻回顧	84
1-3	人類乳突病毒介紹  	86
1-4	聚合酶鏈鎖反應與西方點墨法	91
1-4-1聚合酶鏈鎖反應 (Poly Chain Reaction) ：	91
1-4-2西方點墨法 (Western blotting) ：	92
1-5	原子力顯微術之抗體抗原專一性作用力    	93
1-6	研究背景與動機	97

第二章	實驗部分：	98
2-1	病毒粒子於雲母片上固定化技術	98
2-2	病毒粒子於玻片表面固定化技術	99
2-3	抗體分子於原子力顯微術探針上固定化技術	100
2-4	藥品與儀器	101
2-4-1 藥品部分	101
2-4-2 儀器部分	102
2-5	藥品製備	103
2-6	運用原子力顯微術量測病毒粒子表面微結構之實驗步驟	104
2-7	運用原子力顯微術量測病毒粒子表面蛋白專一性作用力之實驗步驟	105

第三章	實驗結果與討論：	107
3-1	利用PCR與Western blotting確認檢體中含有HPV type-16	107
3-2	純化後HPV type-16病毒顆粒之表面奈米微結構分析	109
3-3	病人檢體(E12)中的HPV type-16直接進行表面奈米微結構分析	111
3-4	病人檢體(E12)中的HPV type-16直接進行表面力學量測分析	114
3-4-1力-距離曲線中各種解離事件的探討	114
3-4-1-1 No unbinding event	114
3-4-1-2 Nonspecific unbinding event	116
3-4-1-2 Specific unbinding event	118
3-4-1-3 Two, triple and multiple specific unbinding event	119
3-4-2 HPV病人與正常人的表面力學量測之差異探討	121

第四章	結論	124

附  錄：	126

參考文獻：	134

圖 目 錄
圖 1. 洋菜膠培養皿中的粘質沙雷氏菌落* 圖 2. 粘質沙雷氏菌**	5
圖 3. 溶菌?生理功能作用示意圖	6
圖 4. 革蘭式陽性菌之細胞壁組成示意圖	8
圖 5. 革蘭式陰性菌之細胞壁組成示意圖	8
圖 6. AFM懸臂樑探針電子顯微鏡圖	10
圖 7. 原子力顯微術(AFM)示意圖    圖 8. 實驗室的AFM機台(SEIKO, JP)	11
圖 9. 原子力顯微術的三種操作模式	13
圖 10. 固定化技術之分類	17
圖 11. 雲母片基材結合連結分子示意圖	18
圖 12. 含硫基之直鏈烷類衍生物作為金基材之連結分子示意圖	18
圖 13. 含氫氧基之直鏈烷類衍生物作為玻璃基材之連結分子示意圖	19
圖 14. 細菌於雲母片上固定化技術(for AFM)示意圖	22
圖 15. NT-MDT原子力顯微鏡套件	24
圖 16. NT-MDT壓電掃描頭	24
圖 17. 運用AFM量測細菌表面微結構之實驗步驟示意圖	25
圖 18. 運用AFM量測經溶菌?作用後的細菌表面微結構之實驗步驟示意圖	26
圖 19. 野生株(CH-1)菌體表面構造(3D images on mica)	27
圖 20. 野生株(CH-1)菌體表面微結構Rmean之次數高斯分布(from圖19)	28
圖 21. 突變株(CH-1△C)菌體表面構造(3D images on mica)	29
圖 22. 突變株(CH-1△C)菌體表面微結構Rmean之次數高斯分布(from圖21)	29
圖 23. 經溶菌?處理後之野生株(Lysozyme treated CH-1)菌體表面構造(3D images on mica)	30
圖 24. 經溶菌?處理後之野生株(Lysozyme treated CH-1)菌體表面微結構Rmean之次數高斯分布(from圖23)	30
圖 25. 經溶菌?處理後之突變株(Lysozyme treated CH-1△C)菌體表面構造(3D images on mica)	31
圖 26. 經溶菌?處理後之突變株(Lysozyme treated CH-1△C)菌體表面微結構Rmean之次數高斯分布(from圖25)	31
圖 27. rssC基因的主要作用基轉位置	32
圖 28. 野生株與突變株經溶菌?作用前後之表面微結構的差異預測	35
圖 29. 近百年全世界大規模流行性感冒與感染原 12	40
圖 30. H1N1電子顯微鏡圖	42
圖 31. 正黏液病毒科(orthomyxoviridae)病毒結構示意圖 	42
圖 32. 流感病毒之神經氨酸?抑制作用 12	43
圖 33. 本研究團隊所合成出的病毒崩(Virusbom)與技轉廠商的商品DM。	47
圖 34. 原子力顯微術(AFM)之探針與樣本的力與距離曲線圖	49
圖 35. 流感病毒粒子於雲母片上固定化技術(for AFM)示意圖	51
圖 36. 原子力顯微鏡之探針專用載台(In air, 氣相)	53
圖 37. 20×20μm2壓電掃描頭(for SPA 300HV型)	53
圖 38. 運用AFM量測H1N1表面微結構之實驗步驟示意圖	54
圖 39. 矩形懸臂樑尺寸關係圖	56
圖 40. 三角形懸臂樑尺寸關係圖	56
圖 41. 懸樑臂探針作用於剛體表面暨比例常數校正示意圖	58
圖 42. 力-距離曲線下之黏滯力與軟硬度分析	59
圖 43. 病毒崩作用前後之H1N1的病毒感染抑制效應	61
圖 44. Topographic images and 3D images of native H1N1 virus particle on mica.	63
圖 45. Topographic images and 3D images of native H1N1 virus particle on mica. (cont.)	64
圖 46. Topographic images and 3D images of native H1N1 virions were treated with 30 ppm VirusBom on mica.	65
圖 47. Topographic images and 3D images of native H1N1 virions were treated with 30 ppm VirusBom on mica. (cont.)	66
圖 48. Phase images and 3D images of native H1N1 virions were treated with 30 ppm VirusBom on mica.	66
圖 49. Topographic images and 3D images of native H1N1 virions were treated with 30 ppm VirusBom on mica.	68
圖 50. Topographic images and 3D images of native H1N1 virions were treated with 30 ppm VirusBom on mica. (cont.)	69
圖 51. Phase images and 3D images of native H1N1 virions were treated with 30 ppm VirusBom on mica.	69
圖 52. AFM mapping analysis of a native H1N1 virion was treated with 300ppm VirusBom.	70
圖 53. Topographic images and 3D images of native H1N1 virions were treated with protease K on mica.	71
圖 54. Topographic images and 3D images of native H1N1 virions were treated with protease K on mica. (cont.)	72
圖 55. Phase images and 3D images of native H1N1 virions were treated with protease K on mica.	72
圖 56. 未經病毒崩處理的病毒顆粒表面力-距離曲線	76
圖 57. 以30ppm病毒崩處理後的病毒顆粒表面力-距離曲線	77
圖 58. 以300ppm病毒崩處理後的病毒顆粒表面力-距離曲線	78
圖 59. 經病毒崩作用前後的病毒顆粒之表面力學量測分析	79
圖 60. HPV電子顯微鏡圖 17       圖 61. HPV type16電子顯微鏡圖 	89
圖 62. HPV表面結構示意圖暨表面結構蛋白L1圖 	90
圖 63. 人類乳突病毒感染黏膜細胞作用基轉示意圖 	90
圖 64. 人類乳突病毒之致癌機轉(for E6與E7蛋白) 	90
圖 65. 聚合?鏈鎖反應示意圖	91
圖 66. 西方點墨法示意圖	92
圖 67. AFM-based nanotools provide a laboratory on a tip for imaging and probing biological membranes at the molecular level. 30	93
圖 68. 各種差異化的力-距離曲線示意圖 28	94
圖69. Adhesion force與unbinding force比較圖29 圖70. unbinding force示意圖 31	95
圖 71. HPV於雲母片上固定化技術(for AFM)示意圖	98
圖 72. HPV於玻片上固定化技術(for AFM)示意圖	99
圖 73. 抗體分子於AFM探針上固定化技術(for AFM)示意圖	100
圖 74. 原子力顯微鏡之探針專用載台(In liquid, 液相)	102
圖 75. 運用AFM量測HPV表面微結構之實驗步驟示意圖	104
圖 76. Unbinding force between HPV16 and HPV16 L1 antibody	105
圖 77. 運用AFM量測HPV表面蛋白專一性作用力之實驗步驟示意圖	106
圖 78. Identification of HPV type 16 from clinical samples by PCR (A) and Western blot (B)	108
圖 79. Topographic images and 3D images of isolated HPV virus particles on mica.	109
圖 80. Isolated HPV virions (3D images, Phase images and corresponding cursor profile)	110
圖 81. AFM mapping analysis of a HPV virion.	110
圖 82. Topographic images and 3D images of HPV virus from HPV patient (E12) on mica.	112
圖 83. HPV virus from HPV patient (E12) (3D images, Phase images and correspond ing cursor profile).	112
圖 84. Topographic images, phase images and contour maps of HPV virus from HPV patient (E12) on mica.	113
圖 85. No unbinding event (bare tip to bare glass).	114
圖 86. No unbinding event (antibody to protein).	115
圖 87. Nonspecific unbinding event.	117
圖 88. Specific unbinding event.	118
圖 89. Two specific unbinding events.	119
圖 90. Triple specific unbinding events.	120
圖 91. Multiple specific unbinding events.	120
圖 92. HPV病人與正常人的表面力學差異(A)Unbinding force, (B)Stiffness.	122
圖 93. 粘質沙雷氏菌(野生株與突變株)經溶菌?作用前後之表面微結構分析。	126
圖 94. 粘質沙雷氏菌(野生株與突變株)之電子顯微鏡圖。	126
圖 95. Native H1N1 virions (Topographic images and corresponding cursor profile)	127
圖 96. Topographic images, 3D images and contour maps of native H1N1 virus on mica.	127
圖 97. H1N1 virions were treated with 30 ppm VirusBom (Topographic images and corresponding cursor profile)	128
圖 98. Topographic images, 3D images and contour maps of native H1N1 virions were treated with 30 ppm VirusBom on mica.	128
圖 99. H1N1 virions were treated with 300 ppm VirusBom (Topographic images and corresponding cursor profile)	129
圖 100. Topographic images, 3D images and contour maps of native H1N1 virions were treated with 300 ppm VirusBom on mica.	129
圖 101. H1N1 virions were treated with Protease K (Topographic images and corresponding cursor profile)	130
圖 102. Topographic images, 3D images and contour maps of native H1N1 virions were treated with Protease K on mica.	130
圖 103. The variation of mechanical property in native H1N1 and H1N1 treated with different concentration ethanol	131
圖 104. 子宮頸癌發展進程	132
圖 105. AFM images of a HPV virus after treatment with protease K (B & B’)	132
圖 106. Other unbinding events between HPV type16 L1 antibody and HPV type16	133

表 目 錄
表 1. 粘質沙雷氏菌小檔案	5
表 2. ANOVA的統計方程式	21
表 3. Data with statistical analyses of cellular surface topographies of rssC mutant CH-1?C compared with wild-type CH-1 before and after treatment with lysozyme.	34
表 4. 流感病毒小檔案	42
表 5. 病毒崩作用前後之H1N1的病毒感染抑制效應(整理表格)	62
表 6. Data with Statistical Analysis of Viral Surface Topographies of Native H1N1 Before and After Treatment with 30ppm and 300ppm VirusBom and Protease K.	75
表 7. 人類乳突病毒小檔案	89
表 8. Statistical analysis of surface topographies of HPV virions from HPV patient.	113
表 9. ANOVA for unbinding force between HPV patient and Normal	122
表 10. ANOVA for stiffness between HPV patient and Normal	123
表 11. Statistical analysis of surface topographies of H1N1 virions (treat with different concentration VirusBom)	131

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