人類神經胜肽Y(human neuropeptide Y；hNPY)在水溶液中具有alpha-螺旋結構，而在低濃度情況下為單體(monomer)結構，在高濃度時則為雙體(dimer)結構。其結構有特定作用機制：先形成單體再與膜微脂粒(membrane micelle)結合，再進一步與GPCRs(G protein-coupled receptors)作用。

    我們利用圓二色光譜(Circular Dichroism)觀察 hNPY【15-29】在不同濃度的TFE水溶液中，其二級結構的變化。並選擇100％ H2O和50％ TFE / 50％ H2O兩種水溶液做結構的測量與討論。再利用二維核磁共振(2D NMR)實驗：COSY、TOCSY、NOESY、[13C, 1H]-HSQC等光譜，完成1H-NMR光譜的序列判定(assignment)之後，可以得到1H和13C的化學位移指標，並能預測 hNPY【15-29】之二級結構形成的區域。

    藉由NOE之距離限制條件(NOE distance constraints)，利用XPLOR軟體進行結構運算以及分子動態模擬焠熄(molecular dynamics simulation annealing)及能量最小化和結構精煉化(refinement)的過程後，得到20個hNPY【15-29】的模擬構型之三度空間結構。

    我們利用脈衝梯度磁場核磁共振(PFG-NMR)實驗，探討 hNPY【15-29】在溶液中是否有聚集(aggregation)的現象，亦即觀察其是否有雙體(dimer)或其他多聚物(oligomer)的形成。並利用氫氘交換實驗來觀測 hNPY【15-29】是否有分子內氫鍵的形成以穩定其分子結構。

    我們綜合CD實驗、CSI(chemical shift index)、分子動力學模擬實驗所得到的結果，可以確定 hNPY【15-29】在100％ H2O中不完全是無序纏繞(random coil)的結構，可能還有其他規則性的二級結構存在；而在50％ TFE / 50％ H2O水溶液中，在殘基Y20到殘基L24的區域會形成alpha-螺旋結構，而且是以單體結構存在於TFE水溶液中。另外我們發現溫度的變化也會影響 hNPY【15-29】之螺旋結構的穩定性，亦即在低溫下的結構比較緊密；在高溫下的結構比較鬆散。

Human neuropeptide Y (hNPY) has a well-defined alpha-helical structure in solution, and is monomer at low concentration, but is dimer at high concentration. It has specific binding mechanism : First, the monomer structure binds with membrane micelle, and further interacts with G-protein coupled receptors (GPCRs).

    We probe into the folding conformation of hNPY【15-29】in difference solvent condition, 100％ H2O and 50％ TFE / 50％ H2O by CD and 2D NMR experiment. Chemical shift index (CSI) of 1H and 13C were acquired after finishing assignments of 2D NMR spectroscopy of COSY, TOCSY, NOESY, and [13C, 1H]-HSQC. By using CSI, we can predict the secondary structure of hNPY【15-29】.

    NOE distance constraints were determined from NOESY spestra. We used XPLOR for structure calculations, including molecular dynamics simulation annealing and energy-minimized process. Twenty refined hNPY【15-29】conformations were resulted from structure simulation.

    We use PFG-NMR to estimate the dissociation and self-association of hNPY【15-29】in aqueous TFE. Also, we investigate whether or not hNPY【15-29】has intramolecular hydrogen bond by performing hydrogen /deuterium exchange experiment.

    Combination of CD, 2D NMR, and structure calculations, PFG-NMR, we assured that hNPY【15-29】assumes not only a conformation of random coil but also other regular secondary structure in 100％ H2O; assumes a monomeric and alpha-helical structure in 50％ TFE / 50％ H2O. At lower temperature, the structure of hNPY【15-29】is more compact while at higher temperature, it is more flexible.

壹、序論………………………………………………………………1
1-1神經胜肽Y之簡介…………………………………………………1
1-1.1神經胜肽Y扮演的角色…………………………………………1
1-1.2NPY家族的由來和特徵…………………………………………1
1-1.3神經胜肽Y的分布和生理活性功能……………………………4
1-1.4水溶液中的NPY和膜微脂粒(micelle)結合之結構變化 ……6
1-2研究目的和方法 …………………………………………………7

貳、蛋白質簡介………………………………………………………9
2-1基本單元：胺基酸 ………………………………………………9
2-2胜肽的定義………………………………………………………11
2-3蛋白質的一級結構………………………………………………12
2-4蛋白質的二級結構………………………………………………13
2-5蛋白質的三級結構………………………………………………17
2-6蛋白質的四級結構………………………………………………17
2-7蛋白質摺疊的中間體……………………………………………17
2-8螺旋蛋白質之熱力學的中間體…………………………………18

參、原理簡介 ………………………………………………………19
3-1圓二色光譜………………………………………………………19
3-1.1CD之基本原理…………………………………………………19
3-1.2蛋白質或多胜肽之CD光譜……………………………………23
3-2二維核磁共振光譜………………………………………………25
3-2.1COSY……………………………………………………………28
3-2.2TOCSY …………………………………………………………30
3-2.3NOESY …………………………………………………………32
3-2.4HSQC……………………………………………………………34
3-3脈衝梯度磁場核磁共振…………………………………………35
3-4DOSY………………………………………………………………39
3-5氫氘交換…………………………………………………………41
3-6化學位移指標……………………………………………………41

肆、實驗部份 ………………………………………………………44
4-1實驗材料…………………………………………………………44
4-2實驗方法…………………………………………………………46
4-2.1CD實驗…………………………………………………………47
4-2.22D NMR實驗……………………………………………………48
4-2.3分子之三度空間結構的模擬計算方法………………………50
4-2.4DOSY實驗………………………………………………………56
4-2.5氫氘交換實驗…………………………………………………58

伍、實驗結果 ………………………………………………………59
5-1圓二色光譜實驗…………………………………………………59
5-2二維核磁共振光譜的判定………………………………………60
5-2.190％ H2O / 10％ D2O之核磁共振光譜 ……………………61
5-2.250％ TFE-D3 / 50％ H2O之核磁共振光譜…………………64
5-3hNPY【15-29】之二級結構分析 ………………………………68
5-43D結構的模擬計算………………………………………………69
5-5溫度係數…………………………………………………………70
5-6DOSY實驗…………………………………………………………70
5-7氫氘交換實驗……………………………………………………72

陸、討論……………………………………………………………124
6-1TFE對hNPY【15-29】之結構的影響 …………………………124
6-2hNPY【15-29】之二級結構的分析……………………………124
6-3hNPY【15-29】之螺旋結構的緊密程度………………………125
6-4hNPY【15-29】在不同溫度下之3D結構的分析………………125
6-5擴散係數和分子量的關係 ……………………………………126
6-6溫度的變化對於hNPY【15-29】之螺旋結構的影響…………126

柒、結論……………………………………………………………129

捌、未來研究與展望………………………………………………131

參考文獻……………………………………………………………132

附錄A ………………………………………………………………138

附錄B ………………………………………………………………162



圖片索引
圖1.1NPY家族之一級結構序列。……………………………………1
圖1.2NPY家族之PP-fold結構。 ……………………………………2
圖1.3NPY家族在水溶液中的單體結構圖。…………………………3
圖1.4hNPY在水溶液中的單體結構圖。 ……………………………3
圖1.5NPY和micelle結合之流程圖。 ………………………………7
圖2.1胺基酸的基本構造。…………………………………………10
圖2.2二十種胺基酸的分類。………………………………………10
圖2.3胜肽鍵的形成。………………………………………………12
圖2.4多胜肽具有游離的N端和C端。………………………………12
圖2.5蛋白質結構的分級。…………………………………………13
圖2.6p軌域電子的共振而造成雙鍵性質。 ………………………14
圖2.7二級結構之Ramachandran圖。………………………………14
圖2.8蛋白質的alpha-螺旋結構。…………………………………16
圖2.9蛋白質的beta-摺板結構。 …………………………………16
圖2.10蛋白質的beta-轉折結構。…………………………………16
圖2.11蛋白質的三級結構。 ………………………………………17
圖2.12TFE溶液可誘導nascent helix形成穩定的螺旋結構。 …18
圖3.1電磁波的行進方向。…………………………………………19
圖3.2光通過旋光性物質後產生圓偏極化光。……………………20
圖3.3(a)平面偏極化光。 …………………………………………21
圖3.3(b)夾角為alpha的兩個圓偏極化光。………………………21
圖3.4CD光譜可分析到蛋白質的二級結構。………………………24
圖3.51D NMR和2D NMR的脈衝序列。………………………………26
圖3.6t1值之線性增加的實驗。……………………………………27
圖3.7COSY實驗的脈衝序列。………………………………………28
圖3.8COSY之 3JH-H-耦合作用。 …………………………………30
圖3.9TOCSY實驗的脈衝序列。 ……………………………………31
圖3.10TOCSY之所有J-耦合作用。…………………………………31
圖3.11NOESY實驗的脈衝序列。……………………………………33
圖3.12NOESY之偶極-偶極耦合作用。 ……………………………34
圖3.13[13C, 1H]-HSQC實驗的脈衝序列。 ………………………35
圖3.14[13C, 1H]-HSQC之1JH-C-耦合作用。 ……………………35
圖3.15PFG-NMR探討的自體擴散。…………………………………36
圖3.16以橢圓球模型表示蛋白質的形狀。 ………………………38
圖3.17DOSY實驗的脈衝序列。 ……………………………………40
圖3.18良好的擴散訊號之衰退曲線。 ……………………………40
圖3.19DOSY光譜是由擴散係數的對數值和化學位移組成的。 …40
圖3.20無序纏繞中20種胺基酸的alpha 1H之化學位移範圍。 …42
圖3.21無序纏繞中20種胺基酸的alpha 13C、beta 13C之化學位移範圍。 ………………………………………………………………43
圖5.1hNPY【15-29】在不同濃度的TFE水溶液之CD疊合圖。……73
圖5.2(a)hNPY【15-29】在CD光譜的二級結構含量分配。………74
圖5.2(b)hNPY【15-29】在CD光譜的二級結構含量曲線圖。……74
圖5.3hNPY【15-29】在100％ H2O和50％ TFE之CD疊合圖。……75
圖5.4hNPY【15-29】在90％ H2O / 10％ D2O之TOCSY光譜的自旋系統判定。 ……………………………………………………………76
圖5.5hNPY【15-29】在90％ H2O / 10％ D2O之TOCSY光譜的脂肪族質子的判定。 ………………………………………………………77
圖5.6hNPY【15-29】在90％ H2O / 10％ D2O之TOCSY光譜的芳香環質子的判定。 ………………………………………………………78
圖5.7hNPY【15-29】在90％ H2O / 10％ D2O之NOESY光譜的daN(i,i+1)之NOE連結。 ………………………………………………79
圖5.8hNPY【15-29】在90％ H2O / 10％ D2O之NOESY光譜的dBN(i,i+1)之NOE連結。 ………………………………………………80
圖5.9hNPY【15-29】在90％ H2O / 10％ D2O之NOESY光譜的dNN(i,i+1)之NOE連結。 ………………………………………………81
圖5.10hNPY【15-29】在90％ H2O / 10％ D2O之NOESY光譜的芳香環質子和殘基內的其他質子之NOE連結。……………………………82
圖5.11hNPY【15-29】在50％ TFE-D3 / 50％ H2O之TOCSY光譜的自旋系統。 ……………………………………………………………83
圖5.12hNPY【15-29】在50％ TFE-D3 / 50％ H2O之TOCSY光譜的脂肪族質子的判定。 …………………………………………………84
圖5.13hNPY【15-29】在50％ TFE-D3 / 50％ H2O之TOCSY光譜的芳香環質子的判定。 …………………………………………………85
圖5.14hNPY【15-29】在50％ TFE-D3 / 50％ H2O之NOESY光譜的daN(i,i+1)之NOE連結。 ………………………………………………86
圖5.15hNPY【15-29】在50％ TFE-D3 / 50％ H2O之NOESY光譜的dBN(i,i+1)之NOE連結。 ………………………………………………87
圖5.16hNPY【15-29】在50％ TFE-D3 / 50％ H2O之NOESY光譜的dNN(i,i+1)之NOE連結。 ………………………………………………88
圖5.17hNPY【15-29】在50％ TFE-D3 / 50％ H2O之NOESY光譜的芳香環質子和殘基內以及殘基間的其他質子之NOE連結。…………89
圖5.18hNPY【15-29】在50％ TFE-D3 / 50％ H2O之NOESY光譜的daN(i,i+2)之NOE連結。 ………………………………………………90
圖5.19hNPY【15-29】在50％ TFE-D3 / 50％ H2O之NOESY光譜的daN(i,i+3)之NOE連結。 ………………………………………………91
圖5.20hNPY【15-29】在50％ TFE-D3 / 50％ H2O之NOESY光譜的daN(i,i+4)之NOE連結。 ………………………………………………92
圖5.21hNPY【15-29】在50％ TFE-D3 / 50％ H2O之NOESY光譜的dBN(i,i+2)之NOE連結。 ………………………………………………93
圖5.22hNPY【15-29】在50％ TFE-D3 / 50％ H2O之NOESY光譜的dBN(i,i+3)之NOE連結。 ………………………………………………94
圖5.23hNPY【15-29】在50％ TFE-D3 / 50％ H2O之NOESY光譜的dBN(i,i+4)之NOE連結。 ………………………………………………95
圖5.24hNPY【15-29】在50％ TFE-D3 / 50％ H2O之NOESY光譜的daB(i,i+3)之NOE連結。 ………………………………………………96
圖5.25hNPY【15-29】在50％ TFE-D3 / 50％ H2O之NOESY光譜的daB(i,i+4)之NOE連結。 ………………………………………………97
圖5.26hNPY【15-29】在100％ H2O和50％ TFE-D3 / 50％ H2O之alpha 1H-化學位移指標。…………………………………………98
圖5.27hNPY【15-29】在100％ H2O和50％ TFE-D3 / 50％ H2O之alpha 13C-化學位移指標。 ………………………………………98
圖5.28(a)hNPY【15-29】在100％ H2O之3D結構圖。……………99
圖5.28(b)hNPY【15-29】在100％ H2O之20個分子結構的背股原子之疊合圖。 ……………………………………………………………99
圖5.29hNPY【15-29】在100％ H2O的二級結構之Ramachandran分析圖。…………………………………………………………………100
圖5.30(a)hNPY【15-29】在50％ TFE-D3 / 50％ H2O，溫度288 K之3D結構圖。…………………………………………………………101
圖5.30(b)hNPY【15-29】在50％ TFE-D3 / 50％ H2O，溫度288 K之20個分子結構的背股原子之疊合圖。……………………………101
圖5.31hNPY【15-29】在50％ TFE-D3 / 50％ H2O，溫度288 K的alpha-helix位置之側鏈原子結構圖。 …………………………102
圖5.32hNPY【15-29】在50％ TFE-D3 / 50％ H2O，溫度288 K的二級結構之Ramachandran分析圖。…………………………………103
圖5.33(a)hNPY【15-29】在50％ TFE-D3 / 50％ H2O，溫度300 K之3D結構圖。…………………………………………………………104
圖5.33(b)hNPY【15-29】在50％ TFE-D3 / 50％ H2O，溫度300 K之20個分子結構的背股原子之疊合圖。……………………………104
圖5.34hNPY【15-29】在50％ TFE-D3 / 50％ H2O，溫度300 K的alpha-helix位置之側鏈原子結構圖。 …………………………105
圖5.35hNPY【15-29】在50％ TFE-D3 / 50％ H2O，溫度300 K的二級結構之Ramachandran分析圖。…………………………………106
圖5.36(a)hNPY【15-29】在50％ TFE-D3 / 50％ H2O，溫度310 K之3D結構圖。…………………………………………………………107
圖5.36(b)hNPY【15-29】在50％ TFE-D3 / 50％ H2O，溫度310 K之20個分子結構的背股原子之疊合圖。……………………………107
圖5.37hNPY【15-29】在50％ TFE-D3 / 50％ H2O，溫度310 K的310-helix位置之側鏈原子結構圖。 ……………………………108
圖5.38hNPY【15-29】在50％ TFE-D3 / 50％ H2O，溫度310 K的二級結構之Ramachandran分析圖。…………………………………109
圖5.39(a)hNPY【15-29】在50％ TFE-D3 / 50％ H2O之不同溫度的NH化學位移分布。…………………………………………………110
圖5.39(b)hNPY【15-29】在50％ TFE-D3 / 50％ H2O之不同溫度的NH之化學位移比較圖。……………………………………………110
圖5.40(a)NH之化學位移差和溫度差的比值。 …………………111
圖5.40(b)不同溫度之間的 ︳Δdelta/ΔT ︳之比較圖。………111
圖5.41hNPY【15-29】在50％ TFE-D3 / 50％ H2O之不同溫度的DOSY光譜疊合圖。………………………………………………………112
圖5.42內標準品TSP的擴散係數和溫度之關係圖。 ……………113
圖5.4350％ TFE / 50％ H2O水溶液的黏度和溫度之關係圖。 113
圖5.44hNPY【15-29】的擴散係數和溫度之關係圖。 …………114
圖5.45hNPY【15-29】用不同溫度的擴散係數所算出的分子量。114
圖5.46(a)hNPY【15-29】在50％ TFE-D3 / 50％ D2O，溫度288 K，20 mins後所收集的1D之氫氘交換圖。……………………………115
圖5.46(b)hNPY【15-29】在50％ TFE-D3 / 50％ D2O，溫度288 K，90 mins後所收集的2D exchange-COSY光譜圖。…………………115



表格索引
表1.1NPY家族與GPCRs結合的程度和生理活性功能。 ……………5
表4.1TSP在不同溫度下的擴散係數。 ……………………………57
表4.250％ TFE水溶液在不同溫度下的黏度。……………………57
表4.3hNPY【15-29】在不同溫度下的擴散係數。 ………………57
表5.1hNPY【15-29】在90％ H2O / 10％ D2O之1H化學位移。 116
表5.2hNPY【15-29】在90％ H2O / 10％ D2O之13C化學位移。117
表5.3hNPY【15-29】在50％ TFE-D3 / 50％ H2O，溫度300 K之1H化學位移。……………………………………………………………118
表5.4hNPY【15-29】在50％ TFE-D3 / 50％ H2O，溫度300 K之13C化學位移。…………………………………………………………119
表5.5hNPY【15-29】在90％ H2O / 10％ D2O之所有NOEs連結。120
表5.6hNPY【15-29】在50％ TFE-D3 / 50％ H2O，溫度288 K之所有NOEs連結。…………………………………………………………121
表5.7hNPY【15-29】在50％ TFE-D3 / 50％ H2O，溫度300 K之所有NOEs連結。…………………………………………………………122
表5.8hNPY【15-29】在50％ TFE-D3 / 50％ H2O，溫度310 K之所有NOEs連結。…………………………………………………………123

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