Mastoparan B自黑腹虎頭蜂蜂毒液中分離出，是蜂毒液中最主要的組成分之一，由十四個胺基酸 (LKLKSIVSWAKKVL-NH2) 所組成，MP-B在水中的構形相當不穩定，而在TFE (三氟乙醇)水溶液中會形成穩定的兩性二級結構 (α螺旋)。然而，隨著溫度的改變，此時MP-B在構形上也發生變化；當高溫的狀態下，無規捲曲 ( random) 為主要結構形態。在此，我們對於溫度改變所產生構形的改變，以及胜肽分子動態行為感到興趣，因此我們希望透過圓二色光譜，核磁共振方法研究 MP-B 在 TFE 水溶液、 SDS 似膜環境中的動力學行為。而結構模擬與計算、擴散實驗 (diffusion) 及 13 Cα 弛緩實驗(relaxation) 得知 MP-B 摺疊過程，經實驗結果對於具芳香環殘基的色胺酸(tryptophan) 在 MP-B 中扮演的角色，也有進一步的討論。

Mastoparan-B(MP-B), is a tetradecapeptide isolated from the venom of the hornet Vespa basalis (LKLKSIVSWAKKVL-NH2).Structure of MP-B is random coil in aqueous solution and folded into an amphiphilic α-helix in the presence of TFE. However, as temperature increase, random coil structure is dominant. In this study, we are interest to insight into the structure transition of coil-helix as temperature varied. We investigate the structure, diffusion and dynamics of MP-B as temperature varied in aqueous TFE and SDS micelle by NMR and CD. The characteristic differences, which may imply the folding process of MP-B, are reported here. Role of tryptophan residue on stabilization of helical structure of MP-B is also characterized.

目錄
目錄	i
圖目錄	iii
表目錄	vi
第一章 緒論	1
1.1蜂毒簡介:	1
1.2 Mastoparan(MP) 家族介紹	2
1.3 Mastoparan B (MP-B) 介紹	3
1.4 研究目的	5
第二章 實驗原理	6
2.1固相胜肽合成(Solid-Phase Peptide Synthesis, SPPS	6
2.2 圓二色旋光光譜儀（Circular Dichroism Spectrometer）	8
2.2.1多胜肽之二級結構CD光譜	12
2.3 核磁共振(Nuclear Magnetic Resonance, NMR)	14
弛緩(Relaxation)	17
2.3.1 二維核磁共振(2D NMR)	20
2.3.1.1 COSY實驗(Correlation Spectroscopy)	22
2.3.1.2 TOCSY實驗(Total Correlation Spectroscopy)	24
2.3.1.3 NOESY實驗(Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy)	25
2.3.1.4 HSQC實驗(Heteronuclear Single Quantum Correlation)	28
2.3.1.5 PFG-NMR DOSY實驗(Diffusion Ordered NMR Spectroscopy)	30
2.3.1.6 化學位移指數及二次化學位移	33
2.4 結構計算(XPLOR原理)	37
2.5無模型法則(Model-Free Approach) 	37
第三章 實驗材料與方法	41
3.1實驗材料	41
3.1.1藥品	41
3.1.2 實驗儀器	43
3.2實驗方法	44
3.2.1 SPPS (胜肽合成)	45
3.2.1.1 試劑配置	45
3.2.1.2 合成	45
3.2.2 抗菌活性測試	47
3.2.3 Circular Dichroism	48
3.2.3.1 樣品的配製	48
3.2.3.2 實驗條件	48
3.2.4 NMR	49
3.2.4.1 樣品配製	49
3.2.4.2 實驗條件	50
3.2.5 結構計算	51
3.2.6 無模型法則(model-free approach)計算	54
第四章 實驗結果和討論	58
4.1 胜肽純化與鑑定	58
4.2抗菌活性測試	60
4.3圓二色旋光光譜	61
4.4核磁共振	63
4.4.1 MP-B在 30% TFE-d3的DOSY光譜	63
4.4核磁共振	67
4.4.2 光譜	67
4.4.2.1 MP-B 3.70 mM在30% TFE-d3，283 K	67
4.4.2.2  MP-B 3.70 mM在30 % TFE-d3，310 K	80
4.4.3 二次化學位移	83
4.5 結構計算	85
4.5 胜肽分子的動態行為	88
4.6 MP-B在SDS-d25中的動態行為	93
第五章 結論	97
第六章 參考資料	98







 
圖目錄
圖1-1: 經幾何模擬粹熄所得到Mastoparan B螺旋結構。	3
圖1-2 : Mastoparan B 與經置換的類似物結構。	4
圖2-1: 固相胜肽合成流程圖，主要過程為：酯化→去保護→活化→耦合→切除。	7
圖2-4: 蛋白質或胜肽的四種主要結構的圓二色旋光光譜。	13
圖2-5: 原子核在磁場B0下產生的磁矩μ繞著磁場進動，頻率為ω。	16
圖2-6: 氫原子在靜磁場中的能量分裂。	16
圖2-7: 原子核吸收RF pulse能量，產生能階狀態的躍遷。	16
圖2-8: 整個系統磁矩向量總和M0產生示意圖。	17
圖2-9: M0受電磁脈衝偏轉到XY平面。	17
圖2-10：M0在Z軸與XY平面弛緩的簡易圖。	18
圖2-11:縱向弛緩實驗脈。	19
圖2-12 : 橫向弛緩實驗脈。	19
圖2-13: Mz’和Mx’-y’與T1、T2關係式與關係圖。	19
圖2-14：二維核磁共振實驗的脈衝序列。	20
圖2-15: 將t1 線性的增加實驗。	21
圖2-16: COSY的脈衝序列。	22
圖2-16: TOCSY的脈衝序列。	24
圖2-17：兩個偶極耦合的自旋，I和S的弛緩路徑，W0、W1和W2分別表示零量子、單量子和雙量子的躍遷。	25
圖2-18: 兩個相鄰胺基酸之間質子的距離。	26
圖2-19: NOESY的脈衝序列。	26
圖2-20: HSQC的脈衝序列。	29
圖2-21：Diffusion的脈衝序列。	31
圖4-1為全梯度下純化出的MP-B。	58
圖4-2: HPLC分析圖，主要峰的滯留時間為16.18分鐘。右上角為經一次純化後的HPLC分析圖。	59
圖4-3經由ESI+-Mass測得其分子量為1614.0493。	59
圖4-4: MP-B的抗菌實驗結果，抑菌濃度介於350 μM – 375 μM。	60
圖4-7: 濃度為3.70 mM的MP-B在10 % D2O/ 30 %TFE-d3/ 60 %H2O水溶液中，溫度為283 K，pH 4.0的條件下之DOSY光譜疊圖。縱軸座標為擴散係數，橫軸座標為1H之化學位移(溫度為283 K, 288 K, 293 K, 298 K, 303 K, 308 K及310 K )。	64
圖4-8 : MP-B在不同溫度下的黏度變化。	65
圖4-9 : MP-B在各溫度的分子量與擴散係數。	65
圖4-10 : MP-B利用DOSY光譜求得在不同溫度下實驗計算出來的分子量( Mexp )與理論分子量(M)的倍數關係。	66
圖4-11 : 濃度為3.70 mM的MP-B在10 % D2O/ 30 %TFE-d3/ 60 %H2O水溶液中，溫度為283 K，pH 4.0的條件下之TOCSY光譜圖。	68
圖4-12 : 濃度為3.70 mM的MP-B在10% D2O/ 30%TFE-d3/ 60%H2O水溶液中，溫度為283 K，pH 4.0的條件下之NOESY光譜圖顯示，dαN(i,i+1)的NOE連結。	69
圖4-13 : 濃度為3.70 mM的MP-B在10% D2O/ 30%TFE-d3/ 60%H2O水溶液中，溫度為283 K，pH 4.0的條件下之NOESY光譜圖，顯示dβN(i,i+1)的NOE連結。	70
圖4-14 : 濃度為3.70 mM的MP-B在10% D2O/ 30 %TFE-d3/ 60 %H2O水溶液中，溫度為283 K，pH 4.0的條件下之NOESY光譜圖，顯示dNN(i,i+1)的NOE連結。	71
圖4-15: 濃度為3.70 mM的MP-B在10 % D2O/ 30%TFE-d3/ 60 %H2O水溶液中，溫度為283 K，pH 4.0的條件下之NOESY光譜圖，顯示dαN(i,i+2)、 dαN(i,i+3) 、dαN(i,i+4)的NOE連結。	72
圖4-16: 濃度為3.70 mM的MP-B在10 % D2O/ 30 %TFE-d3/ 60 %H2O水溶液中，溫度為283 K，pH 4.0的條件下之NOESY光譜圖，顯示dβN(i,i+2)、dβN(i,i+3)和dβN(i,i+4)的NOE連結。	73
圖4-17: 濃度為3.70 mM的MP-B在10 % D2O/ 30 %TFE-d3/ 60 %H2O水溶液中，溫度為283 K，pH 4.0的條件下之NOESY光譜圖，顯示dαβ(i,i+3)、dαβ(i,i+4)的NOE連結。	74
圖4-18: 濃度為3.70 mM的MP-B在10 % D2O/ 30 %TFE-d3/ 60 %H2O水溶液中，溫度為283 K，pH 4.0的條件下之TOCSY光譜圖( F1=7.0~10.0 ppm，F2=7.0~10.0 ppm )。圖中標示了胺基酸芳香環質子的判定。	75
圖4-19: 濃度為3.70 mM的MP-B在10 % D2O/ 30 %TFE-d3/ 60 %H2O水溶液中，溫度為283 K，pH 4.0的條件下之[13C,1H]-HSQC光譜。	76
圖4-21: 濃度為3.70 mM的MP-B在10 % D2O/ 30 %TFE-d3/ 60 %H2O水溶液中，溫度為310 K，pH 4.0的條件下之TOCSY光譜圖。	81
圖4-22: 濃度為3.70 mM的MP-B在10 % D2O/ 30 %TFE-d3/ 60 %H2O水溶液中，溫度為310 K，pH 4.0的條件下之NOESY光譜圖，顯示dNN(i,i+1)的NOE連結。	82
圖4-23 : MP-B在283 K下各殘基與無序纏繞的αH的化學位移差值。	83
圖4-24 : MP-B在283 K下各殘基與無序纏繞的αC的化學位移差值。	84
圖4-25 : MP-B在283 K時，16個能量最小的結構疊圖。	86
圖4-26 : MP-B在283 K的絲帶結構圖，螺旋結構在K4-V13。	86
圖4-27: MP-B以Head on方式觀察側鏈分佈情形。	87
圖4-28: Ramachandran plot圖，顯示雙面繳殘基多座落於右旋的α-helix上。	87
圖4-29: A、B、C為MP-B各殘基在283 K時經弛緩實驗所得T1、T2、NOE。	91
圖4-30: MP-B在283 K各殘基的S2值。	92
圖4-31: 濃度為5mM的MP-B與300 mM的SDS-d25溶於30 % D2O/70 %H2O水溶液中，溫度為310 K之NOESY光譜圖，顯示dNN(i,i+1)的NOE連結。	95
圖4-32: 濃度為5 mM的MP-B與300mM的SDS-d25溶於30 % D2O/70 %H2O水溶液中，溫度為310 K之NOESY光譜圖，顯示芳香環側鏈與SDS亞甲基團的NOE。	96


 
表目錄
表2-1：連續及非連續的NOE可預測產生特定的二級結構。	28
表2-2: 20種常見胺基酸在無規捲曲下，αH的化學位移範圍	35
表2-3: 20種常見的胺基酸在無序纏捲下，αC、CO和βC的化學位移範圍。Gly沒有βC的化學位移範圍，13C的化學位移範圍即為CO的化學位移範圍。	36
表3-1: 合成時所使用活化、偶合和去保護的時間。	46
表3-2 ：圓二色光譜儀的實驗參數。	48
表3-3: MP-B 283K時所設定參數。	50
表3-4: MP-B 283K弛緩實驗的參數設定條件。	50
表4-1 : 純化MP-B所使用的梯度參數。	58
表4-2: MP-B經DOSY實驗的結果整理表。	66
表4-3 : 濃度為3.70 mM的MP-B在10 % D2O/ 30 %TFE-d3/ 60 %H2O水溶液中，溫度為283 K，pH 4.0條件下的1H的化學位移表。	77
表4-4 : 濃度為3.70 mM的MP-B在10 % D2O/ 30 %TFE-d3/ 60 %H2O水溶液中，溫度為283 K，pH 4.0條件下的13C的化學位移表。	78
表4-5: MP-B 283 K NOESY光譜的NOE訊號整理。	79
表4-6: MP-B各殘基在283 K時經弛緩實驗所得T1、T2、NOE等參	90
表4-7: MP-B各殘基S2值與NOE數量統計。	92

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