本研究主要目的在同源表現啤酒酵母菌醇類脫氫酶3 與4（Alcohol Dehydrogenase3、4），並測定其對膽鹼（Choline）的活性。以聚合酶連鎖反應（PCR）進行酵母菌菌株YPH499 的ADH3 和ADH4 基因放大，利用pGEM-T easy vector 做TA-cloning，再將質體DNA 定序，其結果與資料庫SGD 進行比對，以確認序列的正確性。比對結果：所選殖之ADH3 基因與SGD 符合，而ADH4 則有單一核酸多型性（Single Nucleotide Polymorphism, SNP）的現象。接著將ADH3 和ADH4 重組於pYES2 表現載體，再以2％galactose 誘導其在酵母菌（BJ2168）中大量表現。目標蛋白質位於粒線體胞器中[2]，因此在純化策略上，先溶除細胞壁形成原生質球狀體，以便分離粒線體，再採取以超音波粉碎機處理，分離出粒線體粗抽蛋白後，以蛋白質液體色層分析儀（Fast Protein Liquid Chromatography, FPLC）純化之，再檢測其對受質膽鹼的動力學活性。並討論此活性與甜菜鹼（Betaine）代謝之關係。

The main purpose of this research is homologous expression Saccharomyces cerevisiae alcohol dehydrogenase 3 and 4, and determine its activity to choline. Using polymerase chain reaction（PCR）to amplify ADH3 and ADH4 gene from yeast strain YPH499, we utilized pGEM-T easy vector for TA-cloning and sequenced the inserted DNA. The results of sequencing were compared with database SGD in order to confirm the exactness of PCR. We found ADH3 gene that we cloned conforms to databank SGD,but ADH4 has a Single Nucleotide Polymorphism（SNP）. ADH3 and ADH4 were subcloned to expression vector pYES2 , and then induce them to over-express in the Saccharomyces cerevisiae（BJ2168）with 2%galactose. Since both enzymes are mitochondrial proteins, we firstly isolated mitochondria by preparation of spheroplast,then broke the mitochondria by sonication. The protein was purified by Fast Protein Liquid Chromatography（FPLC）, and the enzyme activities determined for ethanol and choline.The kinetic properties are discussed in relation to choline-betaine pathway.

目 錄
中文摘要 i
英文摘要 ii
目錄 iii
圖目錄 vi
第一章 緒論 1
第一節 Choline-betaine pathway 之簡介 1
第二節 Saccharomyces cerevisiae 的醇類去氫酶3 和4 之簡介 5
第三節 實驗目的 6
第二章 實驗方法 7
第一節 選殖 8
（一）選殖至pGEM-T easy vector 8
1-1 複製放大目標基因 8
1-1.1 引子設計 8
1-1.2 模板的製備 9
1-1.3 聚合酶連鎖反應 11
1-2 鑑定PCR 產物 13
iv
1-2.1 瓊膠電泳法 13
1-2.2 限制酶切割反應 15
1-3 TA-cloning 16
1-3.1 接合反應 16
1-3.2 大腸桿菌DH5α 勝任細胞的製備 18
1-3.3 大腸桿菌DH5α 的轉型與藍白篩選 20
1-3.4 抽取質體DNA與定序 22
（二）次選殖至pYES2 26
1-4 插入子與質體DNA 的建構 26
1-4.1 目標基因與質體DNA的製備 26
1-4.2 重組質體DNA 與質體DNA 之限制酶切割反應 27
1-4.3 插入子與質體DNA 之黏合 28
1-4.4 轉型至DH5α 29
1-4.5 篩選 29
第二節 目標蛋白質之過度表現 30
2-1 酵母菌勝任細胞的製備與轉型作用 30
2-2 目標蛋白質的表現 33
2-3 分析粗抽蛋白質 34
2-3.1 SDS-PAGE 膠體電泳法 34
2-3.2 蛋白質的活性分析 37
v
第三節 純化 40
3-1 純化粒線體 40
第三章 結果與討論 42
第一節 選殖 42
（一）選殖至pGEM-T easy vector 42
（二）次選殖至pYES2 50
第二節 目標蛋白質之過度表現 54
第三節 純化 62
第四章 總結 64
參考文獻 65
附錄一、實驗儀器 67
附錄二、Dropout powder 的營養成分及濃度表 69
附錄三、ADH3p 和ADH4p 的胺基酸序列 60
附錄四、pGEM-T easy vector 之特徵圖 71
附錄五、質體pYES2 之特徵圖 72
附錄六、以Blast 比對引子T7 和SP6 定序ADH3之結果 73
附錄七、以Blast 比對引子T7 和SP6 定序ADH4之結果 77
vi
附錄八、ADH3 的coding sequence 81
附錄九、ADH4 的coding sequence 82
附錄十、ZRE 與ADH4 的coding sequence 之比對 83
圖目錄
【圖一】choline-betaine pathway 2
【圖二】PCR 複製放大目標基因ADH3、ADH4 之1.5％瓊膠電泳圖 42
【圖三】限制酶切割PCR 產物之1.5％瓊膠電泳圖 43
【圖四】以1.5％瓊膠電泳分析限制酶EcoRⅠ切割抽出的質體DNA 45
【圖五】以1.5％瓊膠電泳分析限制酶EcoRⅠ切割抽出的質體DNA 46
【圖六】以1.5％瓊膠電泳分析限制酶SacⅠ切割抽出來的質體DNA 46
【圖七】0.8％瓊膠電泳分析限制酶HindⅢ與NotⅠ切割抽取的質體DNA 50
【圖八】0.8％瓊膠電泳分析限制酶XbaⅠ切割抽出的質體DNA 51
【圖九】0.8％瓊膠電泳分析限制酶SacⅠ與NotⅠ切割抽出的質體DNA 52
【圖十】0.8％瓊膠電泳分析限制酶HindⅢ切割抽出的質體DNA 53
【圖十一】誘導ADH3p 表現之12.5％SDS-PAGE 電泳圖 54
【圖十二】ADH3p隨時間表現量的12.5％SDS-PAGE電泳圖 55
【圖十三】誘導ADH4p 表現之12.5％SDS-PAGE 電泳圖 56
【圖十四】加入EDTA，ADH4p 隨時間表現量的12.5％SDS-PAGE 電泳圖 57
vii
【圖十五】未誘導與有誘導ADH3p 的酵母菌粗抽蛋白質以酒精為受質，偵
測其催化活性 59
【圖十六】偵測含過度表現ADH3p 的粗抽蛋白質對choline 的活性 59
【圖十七】未誘導與有誘導ADH4p 的酵母菌粗抽蛋白質以酒精為受質，偵
測其催化活性 60
【圖十八】分離粒線體之12.5％SDS-PAGE 電泳圖 62

參考文獻
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