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系統識別號 U0002-0508201014525600
中文論文名稱 含澱粉酶菌( Exiguobacterium sp. )的分離、鑑定與特性分析
英文論文名稱 Isolation and Characterization of α-Amylase Containing Bacteria (Exiguobacterium sp.)
校院名稱 淡江大學
系所名稱(中) 生命科學研究所碩士班
系所名稱(英) Graduate Institute of Life Sciences
學年度 98
學期 2
出版年 99
研究生中文姓名 宋君陵
研究生英文姓名 Chun-Ling Sung
學號 696180032
學位類別 碩士
語文別 中文
口試日期 2010-07-02
論文頁數 70頁
口試委員 指導教授-簡素芳
委員-陳銘凱
委員-常玉強
委員-簡素芳
中文關鍵字 澱粉酶  Exiguobacterium sp 
英文關鍵字 α-Amylase  Exiguobacterium sp 
學科別分類 學科別醫學與生命科學生物學
中文摘要 α-澱粉酶家族擁有三項共同特徵:在α-糖甘鍵上作用、擁有包含催化端的花籃狀蛋白結構、基因上有4個高度保留區分別和形成催化端與穩定花籃狀蛋白構形有關。本實驗利用基因轉殖方法,嘗試轉殖α-澱粉酶基因片段,透過隨機水解細菌染色體、轉殖入宿主細胞,製做Exiguobacterium sp.的基因圖譜,並以活性染色方式篩選菌株。成功轉殖的片段再經過修飾後轉殖入表達載體,配和表達宿主經過1 mM IPTG誘導後,透過蛋白質膠體染色可看出酵素明顯活性增加。
原菌酵素活性測試為48.82 U/mg,酵素最適pH為6,最適反應溫度為37℃。
英文摘要 The α-amylase family has three common features:Act on α-glycosidic bonds and hydrolyze the bond to α-anomeric oligosacchrides or forming α-1,4 or α-1,6 bond、they all have the (β/α)8 or TIM barrel protein structure
contain the catalytic site、all of them have four highly conserved regions in their primary sequence which contain the amino acids that form the catalytic site and TIM barrel.
DNA library was made by using partial digestion to digest Exiguobacterium sp. chromosome.Then clone into host cell selected by activity staining. Modified the sequence and clone again into pET expression vector system. Add 1 mM IPTG for induce a large amount of protein. Primary supernatant of Exiguobacterium sp. was concentrate and test by DNSA. The special activity was 48.82 U/mg. While the condense supernatant has the optimal condition on pH 6 and 37℃.
論文目次 封面內頁
口試委員審議通過簽名表
授權書
致謝
中文摘要
英文摘要
目錄
圖表目錄

第一章 緒論
第一節 前言 1
第二節 澱粉結構與特性 1
第三節 澱粉酶酵素分類 3
第四節 產生麥芽寡糖澱粉酶的微生物 7

第二章 實驗材料與設備
第一節 實驗材料 8
第二節 實驗設備 9
第三節 培養基配置 11

第三章 實驗方法
第一節 篩選、分離菌株 16
第二節 鑑定分離的菌株
3.2.1 利用PCR方法鑑定菌株 16S rDNA 16
3.2.2 DNA 洋菜電泳 19
3.2.3 純化DNA 20
3.2.4 DNA定序和比對 21
第三節 澱粉酶酵素活性測試
3.3.1 選殖株菌落檢測法 22
3.3.2 SDS 聚丙烯醯胺膠體電泳 (SDS-PAGE) 23
3.3.3 Zymogram 25
3.3.4 醣解酵素活性測定法 26
第四節 澱粉酶基因轉殖
3.4.1 細菌染色體DNA的純化 29
3.4.2 限制酶隨機切割細菌染色體和染色體純化 31
3.4.3 限制酶切割載體、去磷酸化和載體純化 32
3.4.4 DNA 黏合法 34
3.4.5 勝任細胞製備 35
3.4.6 電穿孔法與轉殖 37
3.4.7 轉殖效率計算 38
3.4.8 複製盤和活性測試 39
3.4.9 基因圖譜、定序和比對 40
第五節 轉殖澱粉酶基因的表達
3.5.1 引子設計和PCR程式 41
3.5.2 限制酶切割轉殖基因片段和表達載體的純化 42
3.5.3 表達寄主選殖和製備 44
3.5.4 轉殖基因片段黏合、轉殖和酵素活性測試 45
第六節 轉殖澱粉酶的純化
3.6.1 誘導和活性測試 46

第四章 結果與討論
第一節 16S rDNA鑑定分離的菌株 47
第二節 澱粉酶酵素活性篩選與推估蛋白質大小 47
第三節 澱粉酶基因轉殖與活性篩選 48
第四節 澱粉酶還原醣活性測試 51
第五節 誘導轉殖澱粉酶菌株與純化活性測試比較 52
第六節 澱粉酶保守區蛋白序列與結構比對 52

第五章 總結與未來展望 65
第六章 參考文獻 67
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