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系統識別號 U0002-0408200811000100
中文論文名稱 酵母菌之NNT1及BUD23活性研究
英文論文名稱 Study of the activity of NNT1 and BUD23 of Saccharomyces cerevisiae
校院名稱 淡江大學
系所名稱(中) 生命科學研究所碩士班
系所名稱(英) Graduate Institute of Life Sciences
學年度 96
學期 2
出版年 97
研究生中文姓名 劉建緯
研究生英文姓名 Chien-Wei Liu
學號 694290262
學位類別 碩士
語文別 中文
口試日期 2008-07-15
論文頁數 90頁
口試委員 指導教授-陳銘凱
委員-林賜恩
委員-鐘鳴輝
中文關鍵字 酵母菌  甲基轉移酶  出芽生殖  細胞週期 
英文關鍵字 Saccharomyces cerevisiae  methylltransferase  bud-site selection  cell cycle 
學科別分類 學科別醫學與生命科學生物學
中文摘要 自從人類基因組被定序以來,生命科學的研究主流已經從基因轉成蛋白質體學的領域。對於蛋白質上的修飾調控的相關研究遂成為21世紀生命科學最大的研究方向。例如近年來,組蛋白的離胺酸甲基化作用已被得知在基因的表現及染色質的重建上具有決定性的調控行為。
基因體標註顯示尚有許多未知活性與功能的甲基轉移酶,故本研究利用啤酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)上面的開放讀碼框BUD23及NNT1具有甲基轉移酶的特徵序列的特性,來進行對於甲基轉移酶的相關研究。
BUD23又稱為YCR047C,在酵母菌基因資料庫當中被認為具有參與酵母菌出芽生殖的相關作用,是在整個酵母菌細胞週期當中具有非常重要的地位。
而NNT1也就是YLR285W,具有rDNA silencing以及決定此酵母菌壽命的作用。此基因產物可能為一nicotinamide N-methyltransferase。本篇研究就是要證明這兩個掌控酵母菌生與死的基因本身具有甲基轉移酶的活性。
英文摘要 Since human DNA sequencing is complete, the main areas of life science shift from genomics turn to proteomics. The study of post-translational modification of proteins dominates the research direction of 21st century life science.
For example, recently the lysine methylation of histone has been found to play an important role in regulating gene expression and chromatin remodeling.
Because genome annotation has shown a variety of methyltransferase genes of which the activity and function are still unclear, so in this investigation, I studied two the open reading frames in the yeast genome: YLR285W and YCR047C of Saccharomyces cerevisiae, both of which have been inferred as a methyltransferase by sequence comparison.
YCR047C, also called BUD23, has been shown to be involved in bud-site selection of Saccharomyces cerevisiae. It is an important gene for yeast cell cycle.
YLR285W, also known as NNT1, may encode a nicotinamide N-methyltransferase in yeast. This enzyme has a role in rDNA silencing and in lifespan determination.
This study is aimed to prove the methyltransferase activity of these two putative enzymes which control the life and death of yeast.
論文目次 論文目錄
論文目錄 …………………………………………………... I
致謝 ….……………………………………………………. II
中文摘要 …………………………………………………… III
英文摘要 ………………………………………………..... V
圖表目錄 ………………………………………………….VII
第一章 序論
甲基化概論 ……………………………………………………………………… 1
啤酒酵母菌的簡介 ……………………………………………………………… 7
研究動機與目的 ………………………………………………………………… 9
第二章 實驗材料方法與結果
第一節 目標基因選殖 ………………………………………………………… 10
第二節 重組基因之次選殖 …………………………………………………… 28
第三節 蛋白質表現與純化重組蛋白 ………………………………………… 33
第四節 蛋白質甲基化活性測定 ……………………………………………… 71
第三章 實驗結果討論 …………………………………… 80
附錄
附錄一 縮寫表 …………………………………………...................................... 83
附錄二 BUD23與NNT1之DNA定序表 ……………………………………… 84
參考文獻 …………………………………………………… 88
圖表目錄
圖目錄
第一章 序論
圖一 甲基提供者S-Adenosylmethionine (SAM)的結構 …………………….. 2
圖二 S-Adenosylmethionine (SAM)經蛋白質甲基化作用的結構變化 ……... 2
圖三 N-methylation在Asn上的作用 ………………………………………… 3
圖四 在Asp上的O-methylation作用 ………………………………………… 3
圖五 在Cys上的S-methylation作用 ………………………………………… 3
圖六 在Arg上的C-methylation作用 ………………………………………… 4
圖七 酵母菌出芽生殖之過程 ………………………………………………… 8
圖八 酵母菌減數分裂之過程 ………………………………………………… 8
第二章 實驗材料方法與結果
圖九 PCR目標基因NNT1與BUD23之凝膠電泳圖 …………………….... 17
圖十 BUD23與NNT1 使用NdeI之凝膠電泳圖 ………………………….. 27
圖十一 轉型到BL21的BUD23之生長曲線圖 ……………………………… 43
圖十二 BUD23轉型到BL21並誘導第10~18小時之SDS-PAGE結果 ……. 44
圖十三 BUD23轉型到BL21並誘導第20-24小時之SDS-PAGE結果 …… 44
圖十四 轉型到Rosetta的BUD23之生長曲線圖 …………………………….. 45
圖十五 BUD23轉型到Rosetta並誘導第6~14小時之SDS-PAGE結果 ….. 46
圖十六 BUD23轉型到Rosetta並誘導第16~24小時之SDS-PAGE結果 … 46
圖十七 轉型到BL21的NNT1之生長曲線圖 ………………………………. 47
圖十八 NNT1轉型到BL21並誘導第6~16小時之SDS-PAGE結果 ……… 48
圖十九 NNT1轉型到BL21並誘導第18~24小時之SDS-PAGE結果 …….. 49
圖二十 轉型到Rosetta的NNT1之生長曲線圖 ……………………………… 49
圖二十一NNT1轉型到Rosetta並誘導第6~16小時之SDS-PAGE結果 …… 50
圖二十二NNT1轉型到Rosetta並誘導第18~24小時之SDS-PAGE結果 ….. 51
圖二十三BUD23轉型至BL21(未使用sorbitol)之上下層液超音波破菌之SDS -PAGE結果 ……………………………………………………………………… 53
圖二十四BUD23轉型至Rosetta(未使用sorbitol)之上下層液超音波破菌之SDS -PAGE結果 ……………………………………………………………………… 54
圖二十五BUD23轉型至BL21並加入sorbitol放置於30℃及18℃超音波破菌後之SDS-PAGE結果 ……………………………………………………………… 55
圖二十六BUD23轉型至Rosetta並加入sorbitol放置於30℃及18℃煮破後之SDS-PAGE結果 …………………………………………………………………. 56
圖二十七NNT1轉型至BL21及Rosetta之上下層液超音波破菌之結果 …… 57
圖二十八BUD23轉型至BL21並加入sorbitol放置於 18℃誘導後過His-Tag後之SDS-PAGE結果 …………………………………………………………………. 60
圖二十九NNT1轉型至BL21放置於 30℃誘導後過His-Tag後之結果 ……. 61
圖三十 使用pH7.0 Tris-Cl buffer BUD23過Q-Sepharose resin 所純化出來的SDS-PAGE結果 …………………………………………………………………. 66
圖三十ㄧ使用pH7.0 Tris-Cl buffer BUD23過Q-Sepharose resin 所純化出來11-15管結果 …………………………………………………………………………… 67
圖三十二使用pH7.0 Tris-Cl buffer BUD23過Q-Sepharose resin 所純化出來16-20管結果 …………………………………………………………………………… 68
圖三十三使用pH8.8 Boric-Cl buffer BUD23過Q-Sepharose resin 所純化出來的SDS-PAGE結果 ………………………………………………………………… 69
圖三十四使用pH8.8 Boric-Cl buffer BUD23過Q-Sepharose resin 所純化出來21-25管結果 ……………………………………………………………………. 70
圖三十五使用pH8.8 Boric-Cl buffer BUD23過Q-Sepharose resin 所純化出來26-30管結果 ……………………………………………………………………. 71
圖三十六BUD23、NNT1與其受質反應後的SDS-PAGE結果 ……………… 74
圖三十七SDS-PAGE電泳後的膠片經X光底片處理後沖洗好的底片後的結果 75
圖三十八SDS-PAGE電泳後的膠片經X光底片處理後沖洗好的底片經重新曝光後結果 …………………………………………………………………………… 76
圖三十九BUD23、NNT1再次與其受質反應後的SDS-PAGE結果 ………… 77
圖四十 SDS-PAGE電泳後的膠片經X光底片處理後沖洗好的底片後的結果 78
圖四十一SDS-PAGE電泳後的膠片經X光底片處理後沖洗好的底片經重新曝光後結果 …………………………………………………………………………. 79

表目錄
第二章 實驗材料方法與結果
表一 大腸桿菌在BL21 (DE3)、DH5α及Rosetta的基因型 …………….. 10
表二 PCR各個反應物的濃度比例配方 ………………………………….. 14
表三 PCR反應溫度設定 ………………………………………………….. 14
表四 補A的各反應物濃度配方 ………………………………………….. 19
表五 補A後DNA與pGEM-T Easy Vector的DNA ligation 反應物配方 .. 21
表六 使用Nde I確認plasmid DNA之反應物濃度配方 ………………… 27
表七 使用Bam HI 切第一刀plasmid DNA之反應物濃度配方 ………… 29
表八 使用Nde I切第二刀確認plasmid DNA之反應物濃度配方 ……… 30
表九 BUD23及NNT1各與表現載體pET28c之DNA ligation反應物比例 ..31
表十 配製12.5% separating gel之各反應物比例配方 …………………… 38
表十一 配製3.7% stacking gel之各反應物比例配方 ………………………. 39
表十二 轉型到BL21的BUD23之生長曲線各時間點的OD600詳細數值 … 43
表十三 轉型到Rosetta的BUD23之生長曲線各時間點的OD600詳細數值 ... 45
表十四 轉型到BL21的NNT1之生長曲線各時間點的OD600詳細數值 …… 47
表十五 轉型到Rosetta的NNT1之生長曲線各時間點的OD600詳細數值 …. 49
表十六 作BUD23蛋白質甲基化活性測定之反應溶液配方 …………………. 73
表十七 作NNT1蛋白質甲基化活性測定之反應溶液配方 ………………….. 73


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