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系統識別號 U0002-0108201119331100
中文論文名稱 I.酵母菌YNL035C 在大腸桿菌中的蛋白質表現,純化及甲基化活性 II.酵母菌NNT1p自甲基化活性探討
英文論文名稱 I. Selfmethylation activity of yeast NNT1p II. YNL035Cp of Saccharomyes cerevisiae: expression in Escherichia coli, purification, and methylation activity
校院名稱 淡江大學
系所名稱(中) 化學學系碩士班
系所名稱(英) Department of Chemistry
學年度 99
學期 2
出版年 100
研究生中文姓名 魏政育
研究生英文姓名 Cheng-Yu Wei
學號 698180097
學位類別 碩士
語文別 中文
口試日期 2011-07-19
論文頁數 56頁
口試委員 指導教授-陳銘凱
委員-官宜靜
委員-林賜恩
中文關鍵字 啤酒酵母菌  甲基轉移酶  S-腺苷甲硫氨酸 
英文關鍵字 Saccharomyces cerevisia  Methyltransferase  S-adenosyl-L-methionine 
學科別分類 學科別自然科學化學
中文摘要 蛋白質會由許多種方式來修飾,其中ㄧ種為蛋白質甲基化,而形成蛋白質甲基化的酵素為甲基轉移酶,甲基轉移酶是將S-腺甲硫胺酸 (S-adenosylmethionine)所提供的甲基轉移到蛋白質上。蛋白質的甲基化作用是一種轉譯後修飾常發生於polypeptide chain,他會調節生物的生理作用,包括DNA、RNA的代謝、蛋白質的生成及訊息傳導。已知有些蛋白質甲基化扮演重要的調控角色,然而大部份的蛋白質甲基化所產生的功能還所知有限,目前依然有許多蛋白質甲基化所需的轉移酶尚未找到。
啤酒酵母菌(Saccharomyces calsbergenesis)的YNL035C基因具有甲基轉移酶之特徵序列,將其構築到大腸桿菌(Escherichia coli)中,使其表現重組蛋白,利用His-tag純化法純化出所需蛋白YNL035Cp,再以去除掉YNL035C基因的啤酒酵母菌為受質,以具有放射性的S-腺甲硫胺酸 (S-adenosylmethionine)為輔質測定其活性。以目前實驗的結果並未觀察到YNL035Cp具有甲基轉移之活性。而NNT1p經之前學長實驗結果顯示出可能具有甲基轉之活性,並懷疑可能為自甲基化。所以將NNT1p進行突變使其失去活性,經由具有放射性的甲基轉移反應結果指出,NNT1p可能具有甲基轉移之活性,並可能為自甲基化。
英文摘要 Proteins can be modified in several ways by the addition of methyl groups from S-adenosylmethionine. Methylation regulates a variety of biological functions including DNA and RNA metabolism, protein synthesis and signal transduction. Although in many cases the roles of protein methylation are poorly understood, some have been known to play regulatory roles in the cell. Up to now, there are still many methyltrnasferases for protein methylation that remains to be identified.
The sequence of YNL035C of Saccharomyces cerevisiae matches the sequences of methyltransferase in the database. In this study, We constructed YNL035C into E.coli to express YNL035Cp. We planned to find the activity and substrate of YNL035C. We used His-tag column to purify YNL035Cp. The activity is tested by a reaction containing YNL035Cp , protein extract from ΔYNL035C yeast strains and the consubstrate S-adenosyl-L-methionine of which the methyl being transferred is radioactive. However our method could not see the activity of YNL035Cp. The experimental results of the previous senior student showed the NNT1p had the activity of methyltransferase and may be self-methylated. So we mutated NNT1p for the elimination of activity. According to the result of the radioactive methyl transfer reaction, NNT1p may have the activity of methyltransferase for self-methylation.
論文目次 目錄

謝誌 I
中文摘要 II
英文摘要 III
目錄 IV

緒論 1
研究動機 2
I.酵母菌YNL035C 在大腸桿菌中的蛋白質表現,純化及甲基化活性 4
一、材料 4
1. 酵母菌菌種 4
2. 大腸桿菌菌種 4
3. 質體 5
4. 實驗儀器 5
二、方法 6
1. 萃取啤酒酵母菌BY4742菌種的Genomic DNA 6
2. 引子設計 7
3. 聚合酶鏈鎖反應( polymerase chain reaction; PCR ) 7
4. DNA瓊脂膠體電泳 8
5. 聚合酶反應產物純化 9
6. 在純化產物兩端加上Adenosine(以下簡稱補A) 9
7. 勝任細胞(competent cell)製備 10
8. 基因選殖 11
9. 質體萃取 12
10. 限制酶酵素確認 13
11. 基因定序 13
12. 將YNL035C基因,由pGEM-T Easy Vector構築到表現載體
pET43.1b中 13
12.1接合反應( Ligation ) 14
13.轉型至表現載體( Transformation ) 15
14.YNL035C重組蛋白質表現與純化 15
15.超音波破菌( Sonication ) 16
16.His-tag 融合純化法純化重組蛋白 16
17.測定YNL035C重組蛋白之甲基轉移酶活性 17
18.放射線甲基轉移反應 18
三、結果與討論 20
1.聚合酶鏈鎖反應(PCR)結果 20
2.TA Cloning 之確認 21
3.pET43.1b-YNL035C重組質體的建構 24
4.蛋白質表現及純化重組蛋白 25
5.利用His-taq 純化目標蛋白質 27
6.放射性甲基轉移反應 29
四、結論 30
II.酵母菌NNT1p自甲基化活性探討 32
方法 32
前言 32
1.突變位置(一) 32
1.1突變位置(二) 33
2.定點突變 34
2.1以Dpn1限制酶處理親代模板 36
3.定序確認突變 37
4.轉型至表現載體( Transformation ) 37
5.超音波破菌( Sonication ) 37
6.NNT1蛋白質表現與純化 37
7.放射線甲基轉移反應 38
二、結果 39
(一)突變位置 39
1. 定點突變之引子設計 39
(二)突變位置 40
1.定序結果 44
2.第二次突變的NNT1蛋白質表現及純化 46
3.突變的NNT1p放射線甲基轉移反應結果 47
4.測試不同NNT1p濃度的甲基化活性與突變的NNT1p作比較 49
5.突變的NNT1p及不同濃度的Wild type進行放射性甲基化反應
結果 50
三、討論 52
四、結論 52
參考文獻 54


圖目錄


圖1:利用PCR的方式複製目標基因YNL035C 20
圖2:以EcoR I限制酶進行酶切反應來確認正確接入的YNL035C基因 22
圖3: YNL035C定序結果比較圖 23
圖4:以限制酶Sal I和Hind III分別對含有YNL035C基因片段PET43.1b進行酶切反應 25
圖5:測試YNL035C蛋白質在不同時間的表現圖 26
圖6:利用His-Taq純化YNL035Cp 28
圖7: ΔYNL035C的lysate在不同的OD值有不同的甲基活性表現之變化 30
(圖一)突變的流程圖 36
(圖二)RsmFp與SAM的鍵結圖 40
(圖三)突變的定序圖 44
(圖四)利用His-Taq純化突變的NNT1p 48
(圖五)NNT1p和突變的NNT1p放射性甲基轉移反應的SDS-PAGE蛋白質
電泳圖 46
(圖六)以放射線感應底片偵測NNT1p和突變的NNT1p放射性甲基轉移的反應結果 47

(圖七)突變的NNT1p及不同濃度的Wild type進行放射性甲基化反應的結果 50

(圖八)以SDS-PAGE 電泳分析突變的NNT1p及不同濃度的
Wild type蛋白質表現量之後以放射線感應底片進行壓
片的結果 51




















表目錄




(表1)YNL035C基因的聚合酶鏈鎖反應條件 8
(表2)YNL035Cp和其受質實驗反應方式列表 19
(表一)定點突變的聚合酶鏈鎖反應條件 35
(表二)NNT1p和其受質實驗反應列表 38
(表三)在不同突變位置的分數列表 41

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